李 曄，金麗華*，李 棟，辛秀蘭，陳振婭

（1.北京電子科技職業(yè)學院 生物工程學院，北京 100176；2.北京理工大學 生命學院，北京 100081）

硫酸軟骨素（chondroitinsulfate，CS）是糖胺多糖的一種，是以D-葡萄糖醛酸和2-乙酰氨基-2-脫氧硫酸-D-半乳糖通過β-1,3糖苷鍵相結合的雙糖為基本單位，聚合而成的一類大分子多糖，雙糖單位數(shù)目一般在50～70個，分子質量約在5～50 kDa之間[1-2]。糖胺多糖作為蛋白聚糖的組成成分，主要分布在細胞外基質和細胞表面，用來指導很多生物過程，如細胞增殖，信號傳輸和炎癥介導等[3-4]。

硫酸軟骨素裂解酶（chondroitinase，ChSase）是一類能將糖胺聚糖催化裂解為小分子多糖的酶，ChSase根據(jù)其作用底物的不同分為ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B以及ChSase C等類型。ChSase ABC作為一種多糖裂解酶，可降解諸多底物，如硫酸軟骨素A（CS A）、硫酸軟骨素B（CS B）、硫酸軟骨素C（CS C）透明質酸，這也使得其具有更廣泛的用途。首先ChSase ABC I能將不同種類的高分子質量的CS降解成低分子質量的CS，低分子質量的CS具有更為明顯的藥用及保健效果。其次ChSase ABC I能夠做為檢測CS的有效工具，因其降解CS的產(chǎn)物為不飽和的二糖，此二糖在波長232 nm有強烈的光吸收，可被快速有效的檢測到[5]。ChSase ABC I除去這些降解和檢測功能外，還具有明顯的藥理活性，尤其是對于脊椎損傷后的修復，許多報道都已證明ChSase ABC I能夠降解脊椎損傷后沉積的硫酸軟骨素蛋白多糖中的CS鏈，從而治療脊柱損傷，促進軸突再生，使受體恢復運動和感知功能[6-8]。

ChSase ABC根據(jù)其作用方式的不同，分為ChSase ABC I和ChSase ABC II，ChSase ABC I是內(nèi)切酶，從CS的內(nèi)部進行切割形成不飽和二糖，ChSase ABC II是外切酶，從CS的末端進行切割形成不飽和二糖，由于ChSase ABC I的高活力和用途更為廣泛，所以本研究重點是ChSase ABC I。HAMAI A等[9]從普通變性桿菌中分離純化得到了ChSase ABC I測定了它對不同底物的比活力。HUANG W等[10-11]解析了ChSase ABC I晶體的結構。許多學者也對ChSase ABC I進行了表達研究[12-14]。目前也有許多關于ChSase ABC的固定化和穩(wěn)定性的研究，但是這些酶大多都是從菌株中分離得到，分離步驟繁瑣，且得到的酶活較低，酶的主要來源為多行擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）和溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）[15]。

本研究將來源于普通變形桿菌（Proteus vulgaris）KCTC 2579的ChSase ABC I與MBP融合表達，構建了pMAL-c2x-ChSase ABC I重組載體，并成功在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）高效表達，并且利用直鏈淀粉柱實現(xiàn)了一步純化。酶生物傳感器是將酶作為生物敏感基元，通過各種物理、化學信號轉換器捕捉目標物與敏感基元之間的反應所產(chǎn)生的與目標物濃度成比例關系的可測信號，實現(xiàn)對目標物定量測定的分析儀器。酶生物傳感器在生化分析，臨床測定和環(huán)境探測方面都具有很廣泛的應用。本研究將麥芽糖結合蛋白-硫酸軟骨素酶（MBP-ChSase）ABC I酶固定在聚苯胺載體上，通過自組裝設備聚苯胺修飾電極，研究其對ChSase ABC I的響應，制備生物傳感器，并利用循環(huán)伏安法對其進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通變形桿菌（Proteusvulgaris）KCTC2579：韓國KCTC保藏中心；E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞：北京博邁德生物技術有限公司；pMAL-c2x：本實驗室保存；Q5TM High-Fidelity 2×Master Mix、T4脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）連接酶和所有的限制性內(nèi)切酶：New England Biolabs公司；硫酸軟骨素A（分子質量為50 000 Da）：南京奧多福尼生物科技有限公司；細菌全基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和柱回收試劑盒：美國OMEGA公司；酶固定化材料苯胺、戊二醛、鹽酸、過硫酸胺、戊二醛（glutaraldehyde，GA）（均為分析純）：美國Sigma公司。

Proteus vulgarisKCTC 2579采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏提取物0.3%，蛋白胨0.5%，pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

大腸桿菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

1-14K高速冷凍離心機：美國Sigma公司；MBPTrap HP親和柱（1mL）：美國GE Healthcare公司；電化學工作站（CHI 660，CH instruments from South Korea）及絲網(wǎng)印刷電極（PANI型）：美國CH instruments公司。

1.3 方法

1.3.1 重組質粒pMAL-c2x-ChSase ABC I的構建

將Proteus vulgarisKCTC 2579從安培管中接入到相應的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h，菌體12 000 r/min離心1 min，收集菌體，用細菌全基因組提取試劑盒提取基因組，以此為模板，并采用Q5TMHigh-Fidelity 2×Master Mix對ChSase ABCI進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。根據(jù)已知的ChSase ABCI序列（GenBank：GQ996964.1）設計PCR 引 物，ChSase ABCI-F：5'-CGGGATCCATGGCCACCAGCAATC CTGCATT-3'，ChSase ABCI-R：5'-AACTGCAGTTATCAA GGGAGTGGCGAGAGTTTG-3'。

將擴增得到的ChSase ABC和pMAL-c2x均用BamH I/Pst I酶切，酶切后進行膠回收。然后用T4DNA連接酶進行連接，連接后轉化到E.coliDH5α，并進行菌落PCR，酶切和測序驗證。

1.3.2 重組酶MBP-ChSase ABC I的表達和宿主優(yōu)化

將重組質粒pMAL-c2xChSaseABC I轉化到E.coliDH5α，E.coliBL21，E.coliBL21（DE3），E.coliJM109，E.coliTop10和E.coliTB-1中，用接種環(huán)挑取一環(huán)菌體接種到預先滅菌的裝有4 mL LB培養(yǎng)基和100 μg/mL氨芐青霉素的試管中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h后，作為種子液。按1%的接種量將種子液接到裝液量為50 mL/250 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（OD600nm值為0.6左右）。加入異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG）至濃度為0.5 mmol/L，16 ℃、180 r/min誘導表達20 h。

1.3.3 重組酶MBP-ChSase ABC I的SDS-PAGE分析

將誘導表達20 h后的發(fā)酵液收集菌體，6 000 r/min離心6 min，并用適量的水清洗菌體。加入適量的Tris-HCl，pH 7.4緩沖液重懸菌體，超聲破碎菌體，超聲條件為：超聲5 s，間歇6 s，超聲功率0.3 kW，破碎總時間為15 min。破碎時要保證低溫破碎。破碎液離心后收集上清，并用0.22 μm濾膜過濾上清，過濾后置于冰上備用，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗證蛋白表達量和分子質量。

1.3.4 酶活及比酶活的測定

重組酶MBP-ChSase ABC I可裂解底物硫酸軟骨素A為4,5-不飽和糖醛酸產(chǎn)物，此產(chǎn)物在232 nm波長處有強烈吸收。因此采用波長為232 nm的吸光度值來測定重組酶MBP-ChSase ABC I的酶活[16]，具體測定方法見HE W等[17-18]報道的方法，掃描波長為232 nm，時間為5 min，摩爾消光系數(shù)ε=3 800 L/（mol·cm）。蛋白濃度測定采用Bradford法。

1.3.5 酶的固定化

將重組MBP-ChSase ABC I酶直接固定在已被聚苯胺修飾的電極之上，由于電極表面的聚苯胺載體數(shù)量較少，故在固定化時相應減少酶溶液及交聯(lián)劑的量，具體方法如下：用pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）潤洗電極表面，取10 μL酶溶液涂在電極的中心處，并將電極至于平皿中放置，以防溶液的快速蒸發(fā)，放置1 h后向其中加入10 μL含量為1%的GA溶液，混勻后再靜置2 h，然后用20 μL的PBS緩沖液（pH6.5）清洗電極表面固定區(qū)域，以去除未參與反應的殘留溶液，隨后用20 μL的Tris緩沖液（pH7.9）進行帽化，最后用PBS溶液清洗，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 MBP-ChSase ABC I生物傳感器電化學性能檢測

利用電化學工作站對已制備好的MBP-ChSase ABC I酶生物傳感器進行檢測。此反應中使用了PANI型絲網(wǎng)印刷電極，其工作電極為聚苯胺，通過上面固定化步驟在此電極上固定了重組MBP-ChSase ABC I酶；對電極為Ag/AgCl；參照電極為聚苯胺電極。主要利用循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）進行測試。循環(huán)伏安法是一種常用的電化學研究方法，通過改變電位來得到氧化還原電流。主要是通過施加一個循環(huán)電位來進行掃描，從起始電位以一個固定的速率掃描直至終點電位，再以相同速率掃描回起始電位，如此計為一個循環(huán)[19-20]。本實驗中的酶解反應雖然不是氧化還原反應，但是由于化學反應的存在，會導致在電位掃描過程中出現(xiàn)離子形成離子峰，利用循環(huán)伏安圖判斷出生離子時的電位。

1.3.7 底物硫酸軟骨素A對傳感器的影響

將底物直接作用于電極表面的反應區(qū)，總反應體系為50 μL，通過調節(jié)底物和緩沖溶液的體積來變換底物的濃度。利用循環(huán)伏安法，首先確定電位掃描范圍為-2～+2 V，測定不同底物濃度時生物傳感器在該循環(huán)內(nèi)的電流變化，找到發(fā)生化學反應時的電流峰值。

1.3.8 生物傳感器靈敏度測定

通過電化學工作站利用安培曲線法對生物傳感器進行靈敏度檢測。起始反應段為空白對照，無底物CS A，之后每間隔1 min加入5 μL濃度為1 μmol/L的CS A底物進行反應，第4分鐘時加5 μL濃度為10 μmol/L的CS A底物。利用安培曲線法，觀察加入底物的瞬間電流的變化，以此判斷該傳感器對底物的反應靈敏性。

2 結果與分析

2.1 PCR結果驗證及序列分析

PCR擴增得到ChSase ABCI 見圖1。由圖1可知，退火溫度為60 ℃時，PCR效果最佳，非特異條帶較少。同時，將PCR產(chǎn)物通過測序驗證，結果表明已通過PCR成功獲得ChSaseABCI。將擴增得到的ChSase ABCI和pMAL-c2x均用Bam H I/Pst I酶切，連接轉化后獲得陽性轉化子，提取質粒后，測序驗證重組質粒，表明已成功獲得重組質粒pMAL-c2x-ChSase ABC I。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR結果Fig.1 PCR verification results by agarose gel electrophoresis

2.2 重組酶MBP-ChSase ABC I的表達及宿主優(yōu)化

將成功構建的重組質粒pMAL-c2x-ChSase ABC I分別轉化到E.coliDH5α、E.coliBL21、E.coliBL21（DE3）、E.coliJM109、E.coliTop10和E.coliTB-1中，在相同的條件下誘導表達，分別測定蛋白濃度、酶活和比酶活。結果顯示在E.coliBL21中酶活和比酶活都是最優(yōu)的[21]。

重組酶MBP-ChSase ABC I可裂解底物硫酸軟骨素A成為4,5-不飽和糖醛酸產(chǎn)物，此產(chǎn)物在232 nm波長處有強烈吸收。圖2表明重組酶MBP-ChSase ABC I已成功表達。

圖2 重組酶MBP-ChSase ABC I裂解底物硫酸軟骨素A后的全掃描圖Fig.2 Full scan of the recombinant enzyme MBP-ChSase ABC I after cleaving the substrate chondroitin sulfate A

SDS-PAGE驗證表明重組酶MBP-ChSase ABC I已在BL21（DE3）中成功表達，并且獲得了可溶性的重組酶MBPChSaseABC I，破碎后上清基本包含了80%以上的總蛋白，基本無包涵體存在。重組酶MBP-ChSase ABC I的分子質量約為130 kDa[21]。

2.3 循環(huán)伏安圖

由圖3可知，在0.3～1.0 V區(qū)間有一個離子峰，這個離子峰根據(jù)底物濃度的變化而變化，濃度越高，離子峰的峰值也越高。沒有底物的緩沖液中傳感器的電流信號不是很高，跟底物的信號相比可以近似看為直線。這說明本實驗中的聚苯胺-MBP-ChSase ABC I酶固定化電極對底物的敏感度很強，受緩沖液影響很小。

圖3 不同濃度的CS AC在PANI固定化酶電極中的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammetry diagram of different concentrations of CS AC in PANI immobilized enzyme electrode

2.4 底物CS A濃度對生物傳感器的影響

為了進一步證實作為傳感器的可行性。硫酸軟骨素酶的水解反應液中按照底物濃度的變化產(chǎn)生離子，對這些離子峰部分進行了針對性分析，結果見圖4。由圖4可知，在電壓為0.553 V時，底物濃度在0.1 nmol/L～0.1 μmol/L的范圍內(nèi)，底物濃度與電流成直線關系。這說明聚苯胺-MBP-ChSase ABCI酶固定化電極對底物CS A作為生物傳感器有良好的檢測效果。

圖4 硫酸軟骨素A的標準曲線Fig.4 Standard curve of chondroitin sulfate A

2.5 生物傳感器靈敏度

為了檢測聚苯胺-MBP-ChSase ABC I酶固定化電極的檢測特性繪制i-T曲線，結果見圖5。由圖5可知，電極反應體系為50 μL，每隔1 min加5 μL的1 μmol/L的CS A底物，第4分鐘時加5 μL的10 μmol/L CS A底物。60 s、120 s、180 s、240 s時電流脈沖式增加，隨后馬上進入穩(wěn)定區(qū)。第4分鐘時加入高濃度底物時電流脈沖也隨著升高，并進入穩(wěn)定區(qū)。這說明本實驗中制備的聚苯胺-MBP-ChSase ABC I固定化電極的敏感度比較高，作為底物測定的生物傳感器是一個良好的選擇。

圖5 硫酸軟骨素固定化電極的i-T曲線Fig.5 i-T curve of chondroitin sulfate immobilized electrode

3 討論

目前重組菌構建越來越受到關注，ChSase ABC重組菌也越來越多，但是仍然面臨著許多的困難：一方面通過菌體表達得到的重組酶，表達量不高，活性較低，大多數(shù)都以包涵體形式表達，再經(jīng)過后續(xù)的包涵體分離純化及復性，得到的酶量有限，活性也有損失。另一方面ChSase ABC的分離純化，常用的是硫酸銨沉淀法，這種方法的成本很高，是制約酶工業(yè)化生產(chǎn)的主要瓶頸。另外，ChSase ABC酶的不穩(wěn)定性也制約了該酶在諸如醫(yī)藥領域的應用。本研究通過融合表達方法成功獲得重組酶MBP-ChSase ABC I，包涵體較少，80%以上蛋白均為可溶性蛋白。利用電化學工作站循環(huán)伏安法來探索底物CS A的濃度對生物傳感器的影響，利用安培曲線法檢測該傳感器的靈敏度。結果表明，隨著底物CS A濃度的增加，水解反應速率加快，反應液中產(chǎn)生離子變多電流峰值呈線性增加，CS A濃度在0.1 nmol/L～0.1 μmol/L范圍內(nèi)時，底物濃度與峰值電流有很好的線性關系。在此濃度范圍內(nèi)，該生物傳感器能夠對CS A有效檢測。安培曲線法證明了重組MBP-ChSase ABC I酶在電極上發(fā)生水解反應時，隨著CS A濃度的升高，對電極能檢測到電流瞬時突變，表明了該生物傳感器對底物反應迅速，具有較高的靈敏度。

4 結論

ChSase ABC I是一類能夠將硫酸軟骨素、軟骨素、透明質酸等糖胺多糖降解為寡糖及不飽和二糖的裂解酶。本研究所用的ChSase ABC I來源于Proteus vulgarisKCTC 2579，首次將ChSase ABC I與MBP連接克隆到pMAL-c2x載體上，成功在E.coliBL21（DE3）高效表達。

表達后重組酶MBP-ChSase ABC I的酶活和比酶活分別為3180 IU/L發(fā)酵液和76 IU/mg蛋白，其最佳表達宿主為E.coliBL21（DE3）。SDS-PAGE表明重組酶MBP-ChSase ABC I的分子質量約為130 kDa，可溶性蛋白占80%。在對MBP-ChSaseABC I酶固定在聚苯胺載體上進行研究的基礎上，考察了MBP-ChSase ABC I酶生物傳感器特性。利用循環(huán)伏安法對其進行檢測，選擇CS A作為酶的反應底物，在最適反應條件下，反應的峰值電流與CS A在濃度0.1 nmol/L～0.1 μmol/L范圍內(nèi)呈良好線性關系，可以進行有效檢測。利用安培曲線法證明了該生物傳感器對底物反應迅速，具有較高的靈敏度。