劉萬好，于素珍，2，肖慧琳，鄭秋玲，宋建強，宋志忠，宮 磊，唐美玲，2

（1.山東省煙臺市農業(yè)科學研究院，山東 煙臺 265500；2.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005；3.魯東大學 農學院，山東 煙臺 264025；4.山東省葡萄研究所，山東 濟南 250100）

葡萄（Vitis vinifera）是世界上最重要的果樹之一，分布在世界各地，種植面積超過750萬hm2，世界葡萄產量39%分布在歐洲，亞洲32%，美洲20%[1]，但葡萄易感染病毒病，如葡萄卷葉病毒、葡萄扇葉病毒、沙地葡萄莖痘病毒等。各國都在注重葡萄病毒病的研究[2]，目前，在全世界不同的葡萄品種中已記錄了約70種葡萄病毒和類病毒[3]，國外正在積極使用高通量測序和宏基因組學技術對葡萄病毒生態(tài)進行持續(xù)的全面研究[4-5]。而我國20世紀80年代后才開始研究葡萄病毒病[6]，當前記錄了約20種葡萄病毒病[7]，葡萄卷葉病毒中僅對葡萄卷葉病毒2（grapevine leaf-roll virus 2，GLRaV-2）與葡萄卷葉病毒3（grapevine leaf-roll virus 3，GLRaV-3）的研究較多，對其他病原的研究不足[8]。

煙臺是全國著名的葡萄酒產區(qū)，釀酒葡萄栽培面積約為1萬hm2，主栽品種為8個，蛇龍珠是主栽品種之一，面積約為0.133萬hm2。調查發(fā)現(xiàn)蛇龍珠普遍存在葡萄卷葉病，即葉片反卷變紅現(xiàn)象，發(fā)生率為51.31%～66.26%。本研究通過田間癥狀調查，將蛇龍珠分為葉片反卷和葉片正常兩組，擬研究葉片反卷變紅癥狀對蛇龍珠果實風味物質累積和果實品質的影響，同時利用小核糖核酸（small ribonucleic acid，sRNA）測序技術對兩組植株進行病毒病原鑒定，為培育無病毒蛇龍珠苗木和配套精準化栽培技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛇龍珠葡萄：蓬萊產區(qū)中糧釀酒葡萄基地。株行距為1 m×2 m，單干單臂＋直立葉幕整形。

氫氧化鈉、葡萄糖、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞甲基藍、鹽酸、氯化鉀、無水乙酸鈉、甲醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、沒食子酸、磷鉬酸與無水乙醇等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S電子天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；MDF-382E超低溫冰箱：日本三洋電氣集團；H13237型超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；Centrifuge5430R高速離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 采樣

2018年在蛇龍珠葡萄果實成熟時，田間調查標記出帶有葉片反卷癥狀和非葉片反卷癥狀的葡萄各20株，從葡萄座果期開始分期采樣，于2019年7月8日，7月17日，8月14日，8月29日，9月19日和9月29日在兩組葡萄樹的不同部位隨機選取各10穗健康葡萄果穗，置于裝有冰袋的泡沫箱帶回實驗室備用；隨機在兩組葡萄樹體上的陰陽兩面、果穗上、中、下選取500粒健康果粒，部分直接放入-40 ℃冰箱貯存?zhèn)溆茫糜跍y定果實還原糖與可滴定酸；部分剝取其果皮后放入液氮速凍，研磨成粉，保存于-80 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分析檢測

蛇龍珠葡萄果實還原糖測定采用斐林試劑滴定法[9]；可滴定酸測定采用滴定法[9]；單寧測定采用福林丹尼斯法[9]；總酚測定采用福林-肖卡法[10]；花色苷測定采用pH示差法[11]。各選取卷葉和正常的10棵蛇龍珠，每棵葡萄剪取5根枝條，取其韌皮部，用錫箔紙包裹好并用液氮速凍，用干冰寄往上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司，采用illumina HiSeqTM2500/MiSeq進行高通量測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 小核糖核酸（sRNA）測序質量評估

葉片反卷癥狀（V：病株）sRNA和非葉片反卷癥狀（N：正常）的葡萄進行測序，結果見表1。由表1可知，正常葉片的蛇龍珠原始數(shù)據(jù)為21 300 061，葉片反卷變紅的蛇龍珠原始數(shù)據(jù)為22 625 415，過濾掉原始數(shù)據(jù)中不合格的測序序列（reads）后，得到有效數(shù)據(jù)表現(xiàn)正常的蛇龍珠為21 067 763，有癥狀表現(xiàn)的蛇龍珠為22 373 700，有效率分別為98.91%與98.89%。測序錯誤率僅為0.01%。結果說明2個樣品的測序質量較高，其獲得的轉錄組數(shù)據(jù)可滿足后續(xù)分析的需要。

表1 樣品sRNA測序數(shù)據(jù)評估Table 1 Data evaluation of small RNA sequencing of samples

2.2 小核糖核酸（sRNA）測序病毒篩選

由于病毒感染的植物，大量積累21nt、22nt和24nt病毒短干擾siRNA（short interfering RNA，siRNAs）[12]，因此對上述得到的有效數(shù)據(jù)（clean reads），篩選堿基長度18～26 bp的sRNA來進行后續(xù)分析，結果見表2。由表2可知，兩種處理sRNA總數(shù)和種類都不同：正常的蛇龍珠sRNA總數(shù)和種類分別為14 036 456和1 311 537；卷葉的蛇龍珠sRNA總數(shù)和種類分別為15 839 145和1 532 668。

表2 樣品sRNA種類與數(shù)量Table 2 Types and quantities of sRNA of samples

2.3 小核糖核酸（sRNA）測序鑒定卷葉蛇龍珠病毒種類

將有癥狀與無癥狀的樣品拼接結果進行分類注釋，檢測其病毒分布情況，結果見表3。由表3可知，無癥狀表現(xiàn)植株共766個片段（contigs），其中有153個注釋到非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫，703個注釋到核酸序列數(shù)據(jù)庫，3個注釋到病毒核酸數(shù)據(jù)庫，10個注釋到病毒蛋白數(shù)據(jù)庫，554個注釋到宿主基因組序列數(shù)據(jù)庫。有癥狀表現(xiàn)的植株共1 087個contigs，其中有212個注釋到非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫，1 023個注釋到核酸序列數(shù)據(jù)庫，136個注釋到病毒核酸數(shù)據(jù)庫，82個注釋到病毒蛋白數(shù)據(jù)庫，728個注釋到宿主基因組序列數(shù)據(jù)庫。

表3 病毒注釋結果統(tǒng)計Table 3 Statistics results of virus annotated

葉片正常的蛇龍珠中，只在非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中被注釋到沙地葡萄莖痘病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）一種病毒，contigs數(shù)為2，兩種類病毒分別是葡萄黃斑類病毒（grapevine yellow speckle viroid 1，GYSVd-1）和啤酒花矮化類病毒（hop stunt viroid，HSVd）等類病毒。葉片反卷的蛇龍珠中，共檢測出7種已知葡萄病毒：分別是葡萄卷葉病毒3（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）、葡萄卷葉病毒2（grapevine leafroll-associatedvirus 2，GLRaV-2）、灰比諾病毒（grapevinePinotgrisvirus，GPGV）、沙地葡萄莖痘病毒、葡萄根莖損壞相關病毒（grapevine rootstock stem lesion associated virus，GRSLaV）、葡萄病毒E（grapevine virus E，GVE）和葡萄斑點病毒（grapevine fleck virus，GFkV）。

在核酸序列數(shù)據(jù)庫中被注釋到的病毒最多，葡萄卷葉病毒3 contigs數(shù)為28，葡萄卷葉病毒2 contigs數(shù)為105，灰比諾病毒contigs數(shù)為1，沙地葡萄莖痘病毒contigs數(shù)為4，葡萄根莖損壞相關病毒contigs數(shù)為3，葡萄病毒E contigs數(shù)為1，葡萄斑點病毒contigs數(shù)為1。類病毒有葡萄黃斑類病毒1 contigs數(shù)為1，葡萄黃斑類病毒2（Grapevine yellow speckle viroid 2，GYSVd-2）contigs數(shù)為1，酒花矮化類病毒contigs數(shù)為2，葡萄錘頭狀類病毒contigs數(shù)為4。

在非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中，注釋到葡萄卷葉病毒3 contigs數(shù)為2，葡萄卷葉病毒2 contigs數(shù)為9，沙地葡萄莖痘病毒contigs數(shù)為1，葡萄根莖損壞相關病毒contigs數(shù)為13，未注釋到葡萄類病毒。1種不知名病毒Lausannevirus，contigs數(shù)為1。

在病毒核酸數(shù)據(jù)庫中注釋到葡萄卷葉病毒3 contigs數(shù)為22，葡萄根莖損壞相關病毒contigs數(shù)為107，葡萄斑點病毒contigs數(shù)為1，葡萄病毒E contigs數(shù)為1，灰比諾病毒contigs數(shù)為1。未注釋到葡萄類病毒。2種不知名病毒Tadarida brasiliensis circovirus 1 contigs數(shù)為1，Choristoneura occidentalis granulovirus contigs數(shù)為1。

在病毒蛋白數(shù)據(jù)庫中注釋到葡萄卷葉病毒3 contigs數(shù)為9，葡萄卷葉病毒2 contigs數(shù)為5，葡萄斑點病毒contigs數(shù)為1，葡萄根莖損壞相關病毒contigs數(shù)為53，沙地葡萄莖痘病毒contigs數(shù)為1，未注釋到葡萄類病毒。有大量不知名病毒。

2.4 卷葉對蛇龍珠果實風味物質累積的影響

如圖1所示，蛇龍珠葉片自7月初基部葉片開始反卷，隨著時間的推移，反卷葉片逐漸上移，同時葉脈之間開始出現(xiàn)斑點，逐漸變紅。

圖1 不同采樣時期蛇龍珠葡萄葉片反卷與變紅程度Fig.1 Reverse winding and reddening degree of grape leaves in different sampling periods

如表4所示，反卷葉片蛇龍珠的還原糖、總酚風味物質累積動態(tài)與正常植株基本保持一致，自7月8日開始一直處于含量增加狀態(tài)，到果實成熟采收時含量達到最大；但與正常植株相比，其含量顯著減少（P＜0.05）。自7月17日第二次采樣一直到成熟采收的5次采樣測定，反卷葉片的蛇龍珠還原糖含量與對照相比一直都是顯著降低（P＜0.05），其中7月17日降低最明顯，減少24.05%；反卷葉片的蛇龍珠總酚含量一直都低于正常植株，只有兩次含量（7月8日和9月29日）差別達到顯著水平（P＜0.05），其中7月8日降低最明顯，減少36.90%。

表4 蛇龍珠葡萄果實風味物質含量檢測結果Table 4 Determination results of flavor substance content in Cabernet Gernische grape

反卷葉片蛇龍珠的花色苷累積動態(tài)與正常植株基本一致，含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但總量較剛開始測定時要多。反卷葉片蛇龍珠的花色苷含量一直是低于正常植株，8月14日和8月29日含量達到顯著差異，其中8月4日降低最明顯，減少47.64%。

反卷葉片蛇龍珠可滴定酸累積動態(tài)與正常植株不太一致，雖然總體趨勢是逐漸減少，8月14日之前，含量一直比正常植株低，自8月14日開始含量高于正常植株，是正常植株的1.4倍，一直到采收，與正常植株相比都是顯著性增加（P＜0.05）。

反卷葉片蛇龍珠單寧累積動態(tài)與正常植株不同，含量是增加到8月29日達到最大值，隨后小幅度減少，但至采收前基本恢復到8月29日含量。正常植株單寧含量先增加到8月29日達到最大值，隨后含量減少。葉片反卷蛇龍珠單寧含量8月29日和9月19日比正常含量減少，但幅度不明顯，9月29日果實采收時是正常植株的1.41倍。

3 討論

通過sRNA高通量測序鑒定植物攜帶病毒種類是最新的病毒病原鑒定方法，目前已經在蘋果、葡萄等果樹上應用。高通量同時對幾十萬到幾百萬條脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子測序，能夠檢測到樣本中已知和未知的病毒[13]，現(xiàn)在有很多新病毒是通過該方法獲得的，國外目前也是較多的使用此方法。sRNA測序其原理為植物體內的RNA沉默機制，通過分離特定大小的RNA分子進行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的微小核糖核酸（microRNA，miRNA）分子，鑒定出相關病毒[14]。下一代測序技術的出現(xiàn)使宏基因組學成為植物病毒學的一種可能方法，拓寬了診斷的潛力，并加深了對感染葡萄的病毒病原體的認識[15]。本研究通過sRNA測序鑒定出煙臺產區(qū)葉片反卷的蛇龍珠攜帶7種已知病毒，4種類病毒和多種未知病毒，其中包括能夠促進葉片反卷的卷葉病毒3與卷葉病毒2。而正常植株只攜帶1種病毒和2種類病毒?？梢缘贸鰺熍_產區(qū)蛇龍珠帶毒情況嚴重，至于單株攜帶病毒種類以及哪些病毒導致葉片反卷以及紅斑不同需要進一步深入研究。比起常規(guī)反轉錄-聚合酶鏈反應（reverse trans-cription-polymerase chain reaction，RT-PCR），其檢測結果更精確，不僅確定了病毒種類，還確定了類病毒種類以及未知的病毒。

通過前期的田間調查和田間測定發(fā)現(xiàn)由于攜帶多種病毒和類病毒，葉片反卷植株樹體生長減緩，但也能較好的控制蛇龍珠旺長，導致結果枝百分率和每結果枝果穗數(shù)明顯增加，HALLDORSON M M等[16]也檢測到植株感染葡萄卷葉病毒后芽活力下降。這對于生產者來說是件好事，因為煙臺產區(qū)蛇龍珠普遍存在旺長現(xiàn)象，需要長梢修剪，否則結果枝率偏低。

但通過室內測定指標發(fā)現(xiàn)卷葉植株大部分風味物質累積動態(tài)趨勢與正常植株比較一致，而原糖、總酚、花色苷含量與正常植株相比顯著減少，這與目前AKBAS,B等[17-20]有關葡萄卷葉病研究表明的卷葉病對果實品質影響的結果一致。而本研究測得單寧前期保持不變，隨后經歷了先降低后升高，這與ALABI B等[21]在對梅鹿輒為試材連續(xù)三年的研究結果相同。唯一不同的是可滴定酸含量比正常植株增加，也就是說葉片反卷植株降酸較慢，這在生產上對于煙臺產區(qū)來說又是一個好現(xiàn)象，因為釀酒者普遍反應蛇龍珠這個品種降酸太快。

4 結論

本研究明確了葉片反卷變紅蛇龍珠的主要病毒和類病毒種類，攜帶7種已知病毒與4種類病毒和多種未知病毒，并且對果實品質影響較大，反卷葉片的蛇龍珠還原糖含量顯著降低，其中7月17日降低最明顯，減少24.05%；總酚含量一直都低于正常植株，7月8日降低最明顯，減少36.90%；花色苷含量在8月4日降低最明顯，減少47.64%；單寧累積動態(tài)與正常植株不同。葡萄一旦感染病毒，便終身帶毒，因此一定要培育并采用蛇龍珠無毒苗木，確保葡萄產業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。