馬才仁卓瑪，白瑪普赤，次仁潘多，羅 章，薛 蓓

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850032；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

酪乳和酸奶作為發(fā)酵牛奶制品香甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，含多種人體必需的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等。其發(fā)酵風(fēng)味不僅取決于鮮奶的種類和品質(zhì)，同樣也與發(fā)酵過程中的微生物代謝息息相關(guān)[1-2]。微生物夠利用鮮奶中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵活動(dòng)，進(jìn)而產(chǎn)生各種不同的風(fēng)味[3-5]。西藏林芝地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵制品在以肉為主的林芝人日常生活中扮演著不可或缺的角色[6]。但目前為自制酸奶，人盡皆知的是自制酸奶的環(huán)境是相對(duì)分散和開放的，環(huán)境中存在大量微生物，有一些微生物并不能對(duì)酸奶的發(fā)酵產(chǎn)生有利的影響，環(huán)境存在的某些有害微生物反而會(huì)導(dǎo)致酸奶的品質(zhì)下降，影響食用甚至造成危害[7]。酸奶發(fā)酵主要用的微生物是乳酸菌，而傳統(tǒng)的乳酸菌檢測(cè)方法主要是通過形態(tài)觀察、革蘭氏染色和生化反應(yīng)等進(jìn)行分析，操作簡(jiǎn)單容易得到結(jié)果。但無法用于細(xì)菌大批量分析鑒定[8-9]。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測(cè)序（highthroughput sequencing，HTS）技術(shù)被稱為下一代測(cè)序技術(shù)，由于成本低、可讀量和質(zhì)量高，是目前評(píng)估微生物多樣性的有力工具[10-11]。該技術(shù)越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視，梁明明等[12]通過研究微生物的遺傳穩(wěn)定性結(jié)合感官評(píng)價(jià)機(jī)制成功篩選出了優(yōu)質(zhì)乳酸菌株，楊行等[13]通過基因比對(duì)技術(shù)分析出新疆喀什地區(qū)的酸奶中的優(yōu)勢(shì)菌種為屎腸球菌（Enterococcus faecium），吳均等[14-15]通過對(duì)分離出的乳酸菌株進(jìn)行16S核糖體脫氧核糖核苷酸（16S ribosome deoxyribonucleic acid，16S rDNA）鑒定得出菌株TG1-1為干酪乳桿菌或副干酪乳桿菌，菌株TG1-11為副干酪乳桿菌。

西藏林芝地理位置優(yōu)越，生物資源豐富，生態(tài)地理環(huán)境復(fù)雜多樣，蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，目前未見高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)林芝傳統(tǒng)發(fā)酵型酸奶及酪乳相關(guān)的研究。為了更好地利用這些微生物資源，本研究采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)林芝牧民所食用的傳統(tǒng)酸奶和酪乳中微生物進(jìn)行分析揭示酸奶中的微生物多樣性，并對(duì)細(xì)菌群落類型、結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行研究和分析，為優(yōu)化西藏傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵菌種和工藝提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶（編號(hào)為sn）、酪乳樣品（編號(hào)為nl）：購(gòu)買于西藏林芝市巴宜區(qū)覺木溝農(nóng)牧民家庭（E 94.36°，N 29.64°，海拔2 988 m）。

1.2 儀器與設(shè)備

YP3002N電子天平：上海菁海儀器有限公司；TH-86-150-WA超低溫冰箱：北京天地精儀科技有限公司；ZD-F12冷凍干燥機(jī)：鄭州比朗儀器有限公司；Eppendorf 5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf 公司；ABI GeneAmp?9700 型PCR儀：美國(guó)ABI公司；Illumina Miseq MISEQ測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

發(fā)酵酸奶及酪乳樣品原料牛乳為犏牛牛乳，分別編號(hào)為sn和nl，每個(gè)樣品做3個(gè)平行。樣品購(gòu)買后裝入無菌采樣袋中，放入冰盒內(nèi)，于6 h內(nèi)帶回西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱內(nèi)保藏備用。稱取100 g酸奶及酪乳樣品冷凍干燥后送樣至上海美吉生物有限公司進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增參考文獻(xiàn)[16-17]，具體如下：根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根DP302）說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；使用細(xì)菌通用引物：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為20 μL，4μL5×FastPfu 緩沖液，2 μL2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs），0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu 聚合酶，10 ng DNA模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 Illumina Miseq高通量測(cè)序

利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺(tái)上進(jìn)行在線分析（www.i-sanger.com），采用FastTree軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，使用R語言作圖繪制進(jìn)化樹。結(jié)果可以通過進(jìn)化樹與reads豐度組合圖的形式呈現(xiàn)。其他數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件和Prism 5.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)、質(zhì)控后的優(yōu)化數(shù)據(jù)及操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）統(tǒng)計(jì)見表1。由表1 可知，酪乳（nl）樣品和酸奶（sn）樣品總計(jì)測(cè)得有效序列條數(shù)分別為（58 455±1 145）條和（57 068±1 263）條，共產(chǎn)生（63±2）個(gè)和（25±3）個(gè)OTU，分別包含7個(gè)門、9綱、22目、34科、46屬、61種和7個(gè)門、9綱、22目、34科、46屬、61種。

表1 酸奶和酪乳樣品測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Sequence data statistics of yoghurt and buttermilk samples

不同樣本的OTU韋恩圖見圖1。由圖1可知，2個(gè)樣本中共同含22個(gè)OTU，其中林芝酸奶樣品獨(dú)有3個(gè)OTU，酪乳樣品獨(dú)有41個(gè)OTU，分別占各自O(shè)TU總數(shù)的12%和65%，說明酪乳樣品細(xì)菌多樣性較豐富。

圖1 酸奶和酪乳樣品OTU韋恩圖Fig.1 OTU Venn diagram of yoghurt and buttermilk samples

2.2 稀釋曲線

以多樣性指數(shù)為表征對(duì)實(shí)際觀測(cè)到的物種數(shù)目做稀釋曲線見圖2。由圖2可知，sn和nl樣品的稀釋曲線均基本趨于平緩，說明取樣數(shù)量合理，所得序列可基本反映酸奶和酪乳樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖2 酸奶和酪乳樣品稀釋曲線Fig.2 Dilution curve of yoghurt and buttermilk samples

2.3 樣品Alpha多樣性分析

酸奶和酪乳樣品中的Alpha多樣性指標(biāo)見表2。由表2可知，nl樣品的Sobs指數(shù)、ACE 指數(shù)和Chao1指數(shù)分別為63.00±4.13、65.80±2.14和64.25±3.13，都比sn樣品中相應(yīng)的指數(shù)值大，說明nl樣品具有較高的微生物群落豐富度。

表2 酸奶和酪乳樣品Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistics results of alpha diversity indexes of yoghurt and buttermilk samples

2.4 門水平樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

酸奶和酪乳樣品門水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)結(jié)果見表3。

表3 酸奶和酪乳樣品細(xì)菌在門水平群落結(jié)構(gòu)Table 3 Bacterial community structure of yoghurt and buttermilk samples at phylum level

由表3可知，在門水平分布來看，sn和nl樣品中厚壁菌門（Firmicutes）都排在第一位，其相對(duì)豐度分別為（99.80±3.47）%和（50.76±2.13）%，厚壁菌門（Firmicutes）為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，這是因?yàn)殛笈Ｋ崮讨懈缓罅康娜樗峋?，乳酸菌均為厚壁菌門。sn和nl樣品排在第二位的是變形菌門（Proteobacteria），其相對(duì)豐度分別為（0.07±0.01）%和（35.53±1.12）%，變形菌門是植物土壤中常有的微生物菌門[18-19]，牧民生活環(huán)境惡劣，常常以地為桌，做好的酸奶普遍放在地上，這可能是樣品中均檢測(cè)出少量這些微生物的原因[20]。在sn樣品中并未檢測(cè)到擬桿菌門（Bacteroidetes），而在nl樣品中其相對(duì)豐度為（11.47±0.03）%。

2.5 屬水平樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

酸奶和酪乳樣品屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)見表4。由表4可知，細(xì)菌在屬水平分布來看，乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）和醋桿菌屬（Acetobacter）在sn樣品位于前三位，乳桿菌屬相對(duì)豐度最高，占據(jù)總樣本數(shù)量的（74.32±1.23）%，為優(yōu)勢(shì)菌屬。其次為鏈球菌屬（Streptococcus），占據(jù)總樣本數(shù)量的（25.55±0.45）%，說明鏈球菌屬在牦牛酸奶發(fā)酵過程中可能起著較為重要的作用[20]。在nl樣品的屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度由高到低的排序?yàn)椋喝榍蚓鷮伲↙actococcus）［（48.44±2.13）%］＞不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）［（16.18±1.12）%］＞假單胞菌屬（Pseudomonas）［（15.69±0.89）%］＞金黃桿菌屬（Chryseobacterium）［（11.22±0.56）%］。

表4 酸奶和酪乳樣品細(xì)菌在屬水平群落結(jié)構(gòu)Table 4 Bacterial community structure of yoghurt and buttermilk samples at genus level

2.6 屬水平聚類分析

將林芝傳統(tǒng)發(fā)酵酪乳（nl）和酸奶（sn）進(jìn)行屬水平的細(xì)菌群落TOP50熱圖分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，nl和sn樣品差別較大，共顯示30個(gè)細(xì)菌屬，排名前十的分別是：乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、醋桿菌屬（Acetobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、考克氏菌屬（Kocuria）、明串珠菌屬（Leuconostoc）。根據(jù)樣品的熱圖可知，林芝傳統(tǒng)發(fā)酵酪乳（nl）和酸奶（sn）樣品在屬水平的群落結(jié)構(gòu)具有較大差異性。

圖3 酸奶和酪乳樣品屬水平物種豐富度熱圖Fig.3 Heatmap of species richness of yoghurt and buttermilk samples at genus level

3 結(jié)論

本研究利用Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)西藏林芝農(nóng)牧民家經(jīng)傳統(tǒng)自然發(fā)酵的牦牛酸奶及酪乳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，酪乳（nl）樣品和酸奶（sn）樣品總計(jì)測(cè)得有效序列條數(shù)分別為（58 455±1 145）條和（57 068±1 263）條，共產(chǎn)生（63±2）個(gè)和（25±3）個(gè)OTU，分別包含7門、9綱、22目、34科、46屬、61種和7門、9綱、22目、34科、46屬、61種。通過樣品的Alpha多樣性指數(shù)分析表明，雖然與酸奶樣品相比，酪乳樣品具有更高的群落豐富度，但是兩個(gè)樣品在門水平上的優(yōu)勢(shì)門均是厚壁菌門（Firmicutes），屬水平上，sn樣品的優(yōu)勢(shì)屬為乳桿菌屬（Lactobacillus），其相對(duì)含量為（74.32±1.23）%，nl樣品中細(xì)菌在屬水平上乳球菌屬（Lactococcus）為優(yōu)勢(shì)屬，另外nl樣本中不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）相對(duì)含量較高，說明這三屬在牦牛酪乳發(fā)酵過程中可能起著較為重要的作用。結(jié)果表明，林芝傳統(tǒng)發(fā)酵酪乳（nl）和酸奶（sn）樣品在屬水平的群落結(jié)構(gòu)具有較大差異性。