張興榮，李 峰，賀連智，徐 慧，譚少君，楊 丹，黃艷紅

（山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250014）

環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）是由D-吡喃葡萄糖通過α-1,4-糖苷鍵首尾相連而成的環(huán)狀低聚糖的總稱[1]，通常含有6～12個(gè)葡萄糖基單元，其中研究得較多的是含有6～8個(gè)葡萄糖單元的分子，分別為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精[2]。其中β-環(huán)糊精具有獨(dú)特分子囊結(jié)構(gòu)[3]，該性質(zhì)近年來在食品領(lǐng)域中得到廣泛的開拓與應(yīng)用，如轉(zhuǎn)化食品的形態(tài)、控制食品中香料及香味的揮發(fā)釋放速度、改善食品的口感等[4]。

在醬油發(fā)酵體系中β-環(huán)糊精是由β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（β-cyclodextringlycosyltransferase，β-CGTase）作用于原料中的淀粉、糖原等物質(zhì)產(chǎn)生的。醬油中風(fēng)味化合物有300多種，大多數(shù)成分揮發(fā)性高且穩(wěn)定性差[5-6]，β-環(huán)糊精能與醬油中的香氣成分、維生素、色素等形成相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合物，在一定程度上減少其揮發(fā)和氧化[7-8]，還能夠掩蓋醬油發(fā)酵過程中產(chǎn)生的不快氣味，改善醬油的品質(zhì)，此外它同其他糖類共同構(gòu)成了醬油的體態(tài)和甜味，在一定程度上提高了產(chǎn)品的質(zhì)量[9]。目前，研究較多的產(chǎn)β-CGTase微生物為芽孢桿菌，如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[10]、嗜堿芽孢桿菌（Bacillus alcalophilus）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）[11]，而霉菌在這方面的研究較少。米曲霉是醬油生產(chǎn)過程中的重要菌株，該菌生長(zhǎng)快較粗放，產(chǎn)酶種類豐富，目前對(duì)其的研究也主要集中在果膠酶[12-13]、脂肪酶[14]、蛋白酶[15]、淀粉酶[16]等，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道其產(chǎn)β-CGTase。

本研究從醬醪中篩選出一株產(chǎn)β-CGTase的霉菌，通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其菌種鑒定，采用單因素及響應(yīng)面法對(duì)其產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其所產(chǎn)β-CGTase的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以此為米曲霉產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及其在醬油中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醬醪樣品：山東巧媳婦食品集團(tuán)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基[17]：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖2.5 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH，115 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基[18]：可溶性淀粉10 g/L、蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L、K2HPO40.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、Na2CO30.2 g/L、酚酞0.3 g/L、甲基橙0.1 g/L、瓊脂20 g/L，115 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[19]：200 g馬鈴薯洗凈去皮切碎，加1 000 mL蒸餾水煮沸20 min，紗布過濾，加入20 g葡萄糖充分溶解，115 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基[2]：蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L，K2HPO40.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，自然pH，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

甲基橙、酚酞、Na2CO3、K2HPO3、MgSO4、淀粉、葡萄糖、環(huán)糊精、蔗糖、NH4Cl、（NH4）2SO4、酵母膏、蛋白胨等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）預(yù)混試劑Ⅱ、脫氧核糖核酸（desoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-54A高壓蒸汽滅菌鍋：世得凱儀器設(shè)備（上海）有限公司；HH-BLL-600電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療機(jī)械廠；HDB-03HD生物顯微鏡：上海漢德檢測(cè)技術(shù)有限公司；JD200-3電子分析天平：沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：江蘇蘇靖集團(tuán)有限公司；NSK-2102C恒溫培養(yǎng)箱：上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；A200朗基全觸屏PCR儀：廣州飛迪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的分離

無菌條件下稱取10 g醬醪于100 mL無菌水中，30 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，梯度稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，挑選不同形態(tài)的霉菌菌落進(jìn)行劃線，直至形成單菌落，將其劃線于斜面培養(yǎng)基，4 ℃保存。

1.3.2 產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的篩選[20]

初篩：將分離得到的菌株接種于篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察是否出現(xiàn)淡黃色接近無色的斑點(diǎn)，挑選出產(chǎn)透明圈的菌株。

復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，按照1%（V/V）的接種量將種子液接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量100 mL/250 mL，30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72 h，3 000 r/min離心10 min，制取粗酶液，參照文獻(xiàn)[11]測(cè)定酶活。

1.3.3 高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的鑒定

形態(tài)觀察：將篩選得到的菌株接種于分離培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)的大小，菌絲的高矮，孢子顏色等狀況，同時(shí)制水浸片觀察菌絲體有無橫隔、分生孢子梗、頂囊及分生孢子著生狀況等。

分子生物學(xué)鑒定：采用DNA提取試劑盒對(duì)篩選菌株的DNA進(jìn)行提取，以其為模板，通過引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3'）對(duì)篩選菌株的5.8 ITS rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：模板2 μg，引物ITS4（10 μmol/L）2 μL，引物ITS5（10 μmol/L）2 μL，2×TaqMix 25 μL，加雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性搜索，選同源性較高的模式菌株的5.8 ITS rDNA基因序列，使用MEGA 7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶培養(yǎng)基組成優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用單因素輪換法，依次考察碳源種類（淀粉、環(huán)糊精、葡萄糖、蔗糖）及添加量（0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、氮源種類（蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、氯化銨）及添加量（0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%）、Na2CO3添加量（0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%、0.65%）對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力（Y）為響應(yīng)值，以淀粉添加量（A）、酵母膏添加量（B）及Na2CO3添加量（C）為考察指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.5 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件優(yōu)化

在最佳培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)上，依次考察培養(yǎng)溫度（20℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃）及時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響。

1.3.6 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

（1）不同pH值對(duì)酶活性的影響

β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在不同pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0）的反應(yīng)體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定其最適反應(yīng)pH值。

（2）不同溫度對(duì)酶活性的影響

在最適pH條件下，設(shè)置反應(yīng)體系溫度為25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃，測(cè)定β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，以最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定其最適反應(yīng)溫度。

（3）不同離子對(duì)酶活性的影響

在最適pH及溫度條件下，添加Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+5種離子溶液，調(diào)節(jié)離子的濃度為2.5 mmol/L，測(cè)定β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，以空白對(duì)照的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，確定其對(duì)酶促反應(yīng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株分離及篩選結(jié)果

圖1 菌株D5的初篩結(jié)果Fig.1 Primary screen results of strain D5

圖2 3株菌所產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of activity of β-CGTase produced by 3 strains

從醬醪中共分離得到5株霉菌，通過初篩得到3株產(chǎn)透明圈的菌株，編號(hào)分別為D1、D2、D5，其中菌株D5產(chǎn)生的透明圈見圖1。發(fā)酵后測(cè)定3株菌株的β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力，結(jié)果見圖2。由圖2可知，3株菌株中，菌株D5所產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為1 814 U/mL，因此，選取β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高的菌株D5為目標(biāo)菌株。

2.2 高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察

菌株D5的菌落形態(tài)及菌體形態(tài)見圖3。由圖3可知，菌株D5在分離培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，30 ℃培養(yǎng)72 h，菌落直徑為2～3 cm。菌落初期呈白色、黃色，后期變?yōu)榈G褐色，分生孢子頭呈放射狀，孢子呈黃綠色球形，大小均勻。

圖3 菌株D5的菌落（a）及菌體（b）形態(tài)Fig.3 Colony (a) and mycelium (b) morphology of strain D5

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

基于菌株D5的5.8 ITS rDNA基因序列，使用MEGA 7.0軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4 基于5.8 ITS rDNA基因序列菌株D5的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain D5 based on 5.8 ITS rDNA gene sequences

由圖4可知，菌株D5與米曲霉（Aspergillus oryzae）（MH793844.1）聚于一支，親緣關(guān)系最近，相似度為98%，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，最終鑒定菌株D5為米曲霉（Aspergillus oryzae）。

2.3 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 碳源對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，4種碳源對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響見圖5。由圖5可知，以淀粉為碳源時(shí)，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為2059.01U/mL，因此選取淀粉為最佳碳源。這與曹新志等[21]對(duì)嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶最優(yōu)發(fā)酵碳源結(jié)果一致。淀粉添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響見圖6。由圖6可知，隨著淀粉添加量的增加，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)矸厶砑恿繛?.5%時(shí)，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為2 319 U/mL，因此確定最佳淀粉添加量為1.5%。

圖5 不同碳源對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.5 Effect of different carbon sources on the activity of β-CGTase produced by strain D5

圖6 淀粉添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.6 Effect of starch addition on the activity of β-CGTase produced by strain D5

2.3.2 氮源對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

在最佳碳源的基礎(chǔ)上，考察氮源種類對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，菌株D5能利用無機(jī)氮源，但是在添加無機(jī)氮源的條件下β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力較低，而添加酵母膏的培養(yǎng)基發(fā)酵后，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高為2 161.03 U/mL，分析原因可能是酵母膏中富含多種需氨基酸、維生素、核甘酸、多肽及微量元素更適合菌株的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶。因此選取酵母膏為最適氮源。酵母膏添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響見圖8。由圖8可知，隨著酵母膏添加量的增加，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)酵母膏添加量為1.75%時(shí)，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為2537U/mL，因此確定最佳酵母膏添加量為1.75%。

圖7 不同氮源對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on the activity of β-CGTase produced by strain D5

圖8 不同酵母膏添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.8 Effect of yeast extract addition on the activity of β-CGTase produced by strain D5

2.3.3 Na2CO3添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

在最優(yōu)氮源和碳源的基礎(chǔ)上，考察不同的Na2CO3添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響，結(jié)果見圖9。

圖9 Na2CO3添加量對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響Fig.9 Effect of Na2CO3 addition on the activity of β-CGTase produced by strain D5

由圖9可知，隨著Na2CO3添加量的增加，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)Na2CO3添加量為0.35%時(shí)，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為2788U/mL，因此確定最佳Na2CO3添加量為0.35%。

2.4 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力（Y）為響應(yīng)值，淀粉添加量（A）、酵母膏添加量（B）及Na2CO3添加量（C）為自變量，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation medium component optimization of β-CGTase production by strain D5

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface test results

采用Design-Expert V8.0.6軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行回歸性分析，以酶活（Y）為因變量，淀粉添加量（A）、酵母膏添加量（B）、Na2CO3添加量（C）為自變量，建立回歸方程：

由表3可知，模型的P＜0.05，顯著，失擬值P＞0.05，不顯著，說明該模型較為適合，試驗(yàn)點(diǎn)均可用模型描述。此外，決定系數(shù)R2為0.991 5，表明該模型有較好的可信度，即該模型能夠很好的解釋發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響。由表3亦可知，一次項(xiàng)A及二次項(xiàng)C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)B及二次項(xiàng)B2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他因素對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)離散分析，3個(gè)因素的影響顯著性排序?yàn)锳＞B＞C，即淀粉添加量＞酵母膏添加量＞碳酸鈉添加量。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果建立響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖10。

圖10 各因素交互作用對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力影響的響應(yīng)面及等高線Fig.10 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the activity of β-CGTase produced by strain D5

由圖10可知，淀粉與酵母膏添加量之間的交互作用對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響最大，其次是淀粉添加量與Na2CO3添加量的交互作用，酵母膏添加量與Na2CO3添加量的交互作用最小，與方差分析結(jié)果一致。

由模型計(jì)算得到最佳培養(yǎng)基組成為淀粉添加量2.5%，酵母膏添加量1.85%，Na2CO3添加量0.35%，在此優(yōu)化條件下，菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活為3017.10U/mL。

2.5 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件的研究

2.5.1 發(fā)酵溫度對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

發(fā)酵溫度對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響見圖11。由圖11可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，溫度對(duì)米曲霉的生長(zhǎng)狀態(tài)有重要影響，溫度較低或較高都會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)有抑制作用，其產(chǎn)酶過程也相應(yīng)的受到抑制。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力最高，為3 099.17 U/mL。因此，確定最優(yōu)發(fā)酵溫度為30 ℃，這與朱德艷[22]的研究結(jié)果一致。

圖11 不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.11 Effect of different fermentation temperature on the activity of β-CGTase produced by strain D5

2.5.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響

圖12 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.12 Effect of different fermentation time on the activity of β-CGTase produced by strain D5

發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶活的影響見圖12。由圖12可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力逐漸升高；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，酶活最高為3 208.01 U/mL；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗不利于產(chǎn)酶，因此確定最優(yōu)的發(fā)酵時(shí)間為72 h。

2.6 菌株D5產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果

2.6.1 pH對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響

pH對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響見圖13。由圖13可知，隨著反應(yīng)體系pH值在3.0～8.5范圍內(nèi)升高，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的活力呈上升趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)體系的pH值＞8.5之后酶活開始下降，這表明反應(yīng)液的pH值太高不利于β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的催化降解反應(yīng)，因此確定其酶解的最適反應(yīng)pH值為8.5，可見該酶是一種堿性β-CGTase。在不同pH條件下底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)不同，從而影響酶和底物的結(jié)合，影響酶的穩(wěn)定性。孟艷芬等[23]在對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)生的β-CGTase酶學(xué)性質(zhì)的研究中得出其最適pH值為9.0，同為堿性β-CGTase。

圖13 不同pH值對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.13 Effect of different pH on the activity of β-CGTase

2.6.2 溫度對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響

圖14 不同溫度對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.14 Effect of different temperature on the activity of β-CGTase

在最適pH 8.5的條件下，溫度對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響見圖14。由圖14可知，隨著反應(yīng)體系溫度在25～50 ℃范圍內(nèi)升高，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的相對(duì)酶活呈上升趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度＞50 ℃之后，β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的相對(duì)酶活開始下降，這表明溫度太高不利于β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的催化降解反應(yīng)，因此確定該酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.6.3 金屬離子對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響

金屬離子對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的影響見圖15。由圖15可知，Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Ca2+對(duì)β-CGTase的活力有一定影響，Ca2+對(duì)酶活的影響較小，其他離子均對(duì)該酶的活力有抑制作用，其抑制程度的大小分別為Zn2+＞Mn2+＞Cu2+＞Fe2+，與孟艷芬等[23]的研究結(jié)果一致。

圖15 不同金屬離子對(duì)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.15 Effect of different metal ions on the activity of β-CGTase

3 結(jié)論

本研究從醬醪中篩選得到一株高產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（β-CGTase）菌株D5，通過形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定其為米曲霉（Aspergillus oryzae），采用單因素輪換法和響應(yīng)面法對(duì)該菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳培養(yǎng)基組成為淀粉2.5%、酵母膏1.85%、Na2CO30.35%、K2HPO40.02%、MgSO4·7H2O0.02%，最佳發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為72 h，在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，β-CGTase活力為3 208.01 U/mL。β-CGTase的最適反應(yīng)溫度為50 ℃、最適反應(yīng)pH值為8.5，除Ca2+外，Mn2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+對(duì)該酶的活力有抑制作用，其抑制程度大小為Zn2+＞Mn2+＞Cu2+＞Fe2+。β-CGTase是醬油發(fā)酵體系中研究較少的一種酶類，米曲霉產(chǎn)β-CGTase的研究能夠指導(dǎo)醬油的釀造過程，對(duì)改善醬油的品質(zhì)有重要意義。