孟 娜，黃嘉宏，賈 瑞，魏 明，魏勝華

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000)

全球生態(tài)環(huán)境問(wèn)題越來(lái)越突出,全世界超過(guò)8億hm2土地是鹽堿地，中國(guó)鹽堿土的總面積約為 9 913 萬(wàn)hm2，約占全國(guó)土地面積的1/10[1]，且鹽堿化土壤的面積繼續(xù)呈現(xiàn)擴(kuò)大的趨勢(shì)，已經(jīng)成為制約植物和作物生長(zhǎng)及產(chǎn)量的重要因子之一。大豆(GlycinemaxL. Merr)起源于中國(guó)，屬豆科、蝶形花亞科、大豆屬的二倍體(2n=40)植物，屬中度耐鹽植物，當(dāng)土壤鹽含量超過(guò) 5 dS·m-1時(shí)，其生長(zhǎng)就會(huì)受到傷害[2]。鹽逆境下離子毒害、營(yíng)養(yǎng)失衡和活性氧傷害等是造成植物鹽害的主要原因，其中離子毒害是鹽害的原初和根本因素，Na+和Cl-又是離子毒害的最主要鹽離子[3]，因此，植物的耐鹽性與有效限制Na+和Cl-從根部進(jìn)入地上部分，降低它們?cè)诘厣喜糠值姆e累，達(dá)到胞內(nèi)鹽離子穩(wěn)態(tài)也是植物適應(yīng)鹽逆境的有效策略之一[4]。大量研究表明“忌氯植物”的鹽害作用主要由陰離子Cl-造成，其耐鹽性與葉片中Cl-含量有關(guān)[5-6]，因此，鹽逆境下大豆植株體內(nèi)Cl-吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及其調(diào)控機(jī)制成為大豆耐鹽性研究不可忽視的重要方面。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

試材為栽培大豆(GlycinemaxL. Merrill)品種‘中黃13’,材料幼苗參照前期培養(yǎng)方法[19]，Cl-通道抑制劑濃度參照文獻(xiàn)選擇20 μg·L-1[17]。取籽粒飽滿(mǎn)、大小一致的種子經(jīng)0.05% HgCl2消毒5 min,自來(lái)水沖洗后于25 ℃浸種約 6 h，然后25 ℃恒溫箱避光催芽。挑選發(fā)芽一致的種子于裝有石英砂的具孔的塑料杯中(200 mL)放入盛有1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中。待第1對(duì)真葉完全展開(kāi)時(shí)，取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至具孔的泡沫板于盛有 1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中水培。當(dāng)大豆幼苗第1片三出復(fù)葉完全展開(kāi)后，將幼苗隨機(jī)分成5組：第1組大豆幼苗繼續(xù)培養(yǎng)在1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(Control)；第2組大豆幼苗培養(yǎng)在含150 mmol·L-1NaCl的 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(NaCl)；第3組大豆幼苗培養(yǎng)在含150 mmol·L-1NaCl的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液加20 μg·L-1氯化鋅(NaCl+ZnCl2)；第4組大豆幼苗培養(yǎng)在含150 mmol·L-1NaCl的 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液加20 μg·L-19-羧酸(NaCl+9-AC)；第5組大豆幼苗培養(yǎng)在含150 mmol·L-1NaCl的 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液加20 μg·L-1尼氟滅酸(NaCl+NFA)。1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液每2 d更換1次，鹽脅迫處理10 d，對(duì)幼苗相關(guān)指標(biāo)根長(zhǎng)、株高、葉主脈和根部解剖結(jié)構(gòu)以及葉部離子含量等進(jìn)行測(cè)定。

1.2 根長(zhǎng)和株高的測(cè)定

取發(fā)育良好、長(zhǎng)勢(shì)較一致的大豆幼苗,分別用直尺測(cè)量主根長(zhǎng)度及株高[19]。

1.3 根部和葉主脈解剖結(jié)構(gòu)的制片方法

根部和葉主脈解剖結(jié)構(gòu)采用石蠟制片法[20]。各處理組試材分別截取主根相同部位0.5～1 cm的小段、葉為第1片三出復(fù)葉的頂葉5 mm×5 mm樣品，分別放入新鮮FAA固定液中[V(40%甲醛)∶V(冰乙酸)∶V(70%乙醇)=5∶5∶90]，抽取真空至材料下沉，固定48 h以上，4 ℃保存，備用。固定后的試材切片厚度8 μm，采用常規(guī)番紅-固綠對(duì)染色法染色，并用加拿大樹(shù)膠封片，觀察并顯微拍照。測(cè)定相關(guān)參數(shù)(根平均直徑、皮層平均厚度、皮層厚度/根直徑、導(dǎo)管平均直徑、中柱平均直徑、中柱直徑/根直徑，次生導(dǎo)管平均直徑、葉維管束直徑/葉主脈厚度，根中柱直徑/根直徑)。試驗(yàn)重復(fù)3 批次，每重復(fù)3個(gè)樣片，取平 均值。

1.4 離子含量測(cè)定方法

1.5 數(shù)據(jù)分析

以上試驗(yàn)均3批次重復(fù)，每批次3個(gè)重復(fù)。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行均值、標(biāo)準(zhǔn)差和差異顯著性分析，不同字母表示數(shù)據(jù)間的差異顯著性(P<0.05) 。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯離子通道抑制劑處理下大豆植株表型比較

在正常1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，大豆幼苗生長(zhǎng)旺盛，枝葉繁茂；經(jīng)150 mmol·L-1NaCl處理10 d后，植株矮小，低部葉片有干枯、脫落現(xiàn)象，根部長(zhǎng)度降低；150 mmol·L-1NaCl處理外加Zn2+(NaCl+ZnCl2)處理后，植株生長(zhǎng)均有所好轉(zhuǎn)，植株生長(zhǎng)良好，葉片無(wú)干枯、脫落現(xiàn)象，株高和根長(zhǎng)均回升；150 mmol·L-1NaCl處理外加9-AC(NaCl+9-AC)處理后，大豆幼苗的生長(zhǎng)情況接近單獨(dú)鹽處理(圖1)；150 mmol·L-1NaCl處理外加NFA(NaCl+NFA)時(shí)，大豆幼苗第6天時(shí)干枯至死亡。通過(guò)前期結(jié)果后續(xù)試驗(yàn)選擇Zn2+(20 μg·L-1)作為氯離子通道抑制劑。

A.植株表型；B.株高；C.根部；D.根長(zhǎng)。不同氯離子通道抑制劑大豆幼苗經(jīng)鹽逆境處理10 d植株表型圖，從左到右依次是‘中黃13’1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(Control), 150 mmol·L-1 NaCl處理(NaCl)，150 mmol·L-1 NaCl處理+ 20 μg·L-1 Zn2+(NaCl+Zn2+)，150 mmol·L-1 NaCl處理+ 20 μg·L-1 9-AC(NaCl+9-AC)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均3個(gè)重復(fù)，不同字母表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)

2.2 大豆幼苗根部和葉中脈解剖結(jié)構(gòu)

不同處理的栽培品種‘中黃13’幼苗對(duì)照葉中脈粗大，維管束較發(fā)達(dá)，次生木質(zhì)部導(dǎo)管平均孔徑為38.62 μm，維管束上下方機(jī)械組織發(fā)達(dá)，導(dǎo)致葉脈上下面有顯著凸起；鹽脅迫下，大豆幼苗葉中脈，維管束直徑、次生導(dǎo)管直徑分別降至 615.06 μm和19.75 μm，機(jī)械組織不發(fā)達(dá)，維管束直徑占葉主脈厚度的比例為31.09%，明顯小于對(duì)照；ZnCl2處理后在葉中脈中維管束所占比例有所提高，達(dá)到36.51%，介于對(duì)照與鹽逆境處理之間(圖2-A和圖3)。

正常條件下生長(zhǎng)的大豆幼苗根部表皮細(xì)胞排列緊密，橫切面呈長(zhǎng)方形(圖2-B)；次生木質(zhì)部導(dǎo)管孔徑55.38 μm，大而密集，管孔鏈所占比例較大；皮層細(xì)胞間隙大，所占根部的比例較小；維管柱占根部的比例較大。鹽脅迫下，大豆幼苗根部橫切面整體形態(tài)及維管柱細(xì)胞變??；表皮細(xì)胞向內(nèi)凹陷；次生木質(zhì)部導(dǎo)管平均直徑均降至33.66 μm，且數(shù)量減少，主要以單管孔為主；維管柱占根部的比例由對(duì)照52.38%降至41.21%，然而，皮層占根部的比例則相反，由對(duì)照22.80%增加至26.62%(表1和圖3)。鹽處理外加ZnCl2，根部表皮細(xì)胞排列較整齊，向內(nèi)凹陷減少；有少量徑向和切向管孔鏈，次生木質(zhì)部導(dǎo)管數(shù)量和平均直徑、根平均直徑、皮層厚度和中柱平均直徑均回升，介于對(duì)照和鹽脅迫之間(圖2-B和圖3)。

2.3 大豆幼苗離子含量指標(biāo)比較

3 討 論

植物Cl-通道蛋白是由在生物膜上蛋白質(zhì)大

大豆幼苗經(jīng)鹽逆境處理9 d植株表型圖，從左到右依次是‘中黃13’ 1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)(Control), 150 mmol·L-1 NaCl處理(NaCl)，150 mmol·L-1 NaCl處理+ 20 μg·L-1 Zn2+(NaCl+Zn2+)。c.皮層；vb.維管束；pp.柵欄組織；ec.表皮細(xì)胞；x.木質(zhì)部； p.韌皮部

表1 栽培品種‘中黃13’不同處理根內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)特征參數(shù)Table 1 Anatomical structure of roots in Glycine max cultivar‘Zhonghuang 13’

分子組成的跨膜孔道蛋白，目前已在擬南芥、煙草、水稻、馬鈴薯、玉米、大豆等植物中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[24]。由于陰離子(如Cl-等)在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑敏感，且抑制劑具有專(zhuān)一性和靈敏度不高的特點(diǎn)，選擇合適的Cl-通道抑制劑對(duì)研究大豆作物的耐鹽/氯機(jī)制具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽逆境下外加氯離子抑制劑的作用效果依次表現(xiàn)為Zn2+> NaCl ≈ 9-AC > NAF，表明外加Zn2+能緩解大豆幼苗的鹽害作用，而NAF反而加重鹽害作用導(dǎo)致大豆幼苗無(wú)法正常生長(zhǎng)，此研究結(jié)果與屈婭娜等[17]的結(jié)果相一致，其主要原因可能與Zn2+對(duì)超極化激活型Cl-通道(內(nèi)流Cl-通道)起抑制作用,而NFA對(duì)去極化激活型Cl-通道(外流Cl-通道)起抑制作用[16]，但具體調(diào)控Cl-內(nèi)流的基因和分子機(jī)制仍需進(jìn)一步挖掘。

圖4 氯離子通道抑制劑(Zn2+)處理下栽培大豆‘中黃13’葉部離子含量Fig.4 Lons content sinsoy bean leaves under Zn2+ treatment

總之，高等植物對(duì)鹽逆境的適應(yīng)是一個(gè)綜合的生物調(diào)節(jié)過(guò)程，需要各種生理生化過(guò)程及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化的協(xié)同作用。本研究通過(guò)對(duì)不同氯離子抑制劑的作用效果，發(fā)現(xiàn)Zn2+可以通過(guò)改變大豆幼苗根部和葉主脈木質(zhì)部結(jié)構(gòu)和根部皮層厚度比例調(diào)控離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，降低葉部Cl-含量，從而緩解鹽逆境對(duì)大豆幼苗的鹽/氯傷害，認(rèn)為Zn2+是栽培大豆合適的Cl-通道抑制劑。然而，對(duì)于木質(zhì)部?jī)?nèi)部孔道微觀結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)的顯微鏡技術(shù)已不能滿(mǎn)足對(duì)植物內(nèi)部復(fù)雜精細(xì)結(jié)構(gòu)的觀測(cè)，在未來(lái)研究中可采用先進(jìn)技術(shù)手段建立清晰的木質(zhì)部3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，嘗試從精細(xì)的微觀結(jié)構(gòu)的變化解析鹽逆境下Zn2+對(duì)離子吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和含量的影響。同時(shí)將迅速發(fā)展的分子技術(shù)手段結(jié)合已公布的大豆基因組序列[28]，可以把Zn2+與NAF作為正反參照，進(jìn)一步探究Zn2+抑制Cl-內(nèi)流的具體調(diào)控基因和分子機(jī)制，以期從Cl-通道抑制劑這一視角為大豆耐逆研究提供理論依據(jù)。