劉 放,魏小紅,張小芳,朱雪妹,馮 悅
(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070;2.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070;3.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070)
番茄黃化曲葉病毒病 (Tomato yellow leaf curl virus disease,TYLCVD)是由黃化曲葉病毒( Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV簡(jiǎn)稱TY)引起的一種對(duì)番茄產(chǎn)生毀滅性危害的一種病害,屬于雙生病毒科(Family Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)[1]的一類具有孿生顆粒形態(tài)的植物DNA病毒[2]。最早在20世紀(jì)50年代后期發(fā)現(xiàn)于阿拉伯半島的西北部等地區(qū)[3],1964年被命名為黃化曲葉病毒病[4],煙粉虱(Bemisiatabaci)是其主要的傳播方式[5]。中國(guó)首次于2006年在上海發(fā)現(xiàn)黃化曲葉病[6],近年來(lái),該病毒已在上海、北京、新疆、安徽、浙江、天津、四川、陜西等地區(qū)大范圍爆發(fā)[7]。目前針對(duì)對(duì)番茄黃化曲葉病毒病的防治主要以控制煙粉虱為主,但由于煙粉虱繁殖能力及其遷飛能力頻率較高,并未取得理想的防治效果,目前抗病品種選育是當(dāng)前防治TYLCV的最好方法之一[8-10]。
植物的防衛(wèi)反應(yīng)是由酶催化產(chǎn)生的一系列復(fù)雜生理生化代謝的結(jié)果[11],防御酶是植物體內(nèi)抵制病原侵染的有關(guān)物質(zhì),其活性的變化通常作為衡量植物體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)的重要指標(biāo)[12]。研究表明,其活性的高低與植物的抗病能力之間存在正相關(guān)關(guān)系[13-14]。目前已經(jīng)在一些野生番茄中發(fā)現(xiàn)TYLCV的抗性基因,包括Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4和ty-5、Ty-6等[15],其中Ty-1、Ty-2和Ty-3在中國(guó)番茄種質(zhì)資源中開(kāi)發(fā)和利用較多[16]。這些抗性基因在育種中已成功應(yīng)用,如瑞士先正達(dá)公司選育的‘拉比’和‘齊達(dá)利’里面都含有Ty-3a基因,法國(guó) Clause 公司選育的‘寶麗’含Ty-3a基因,中國(guó)選育的‘浙粉701’含Ty-2基因,‘浙雜502’含有Ty-3a基因[17]。為了更加方便快捷地檢測(cè)番茄攜帶抗性基因,針對(duì) TYLCV 主要的抗性基因開(kāi)發(fā)了一系列的分子標(biāo)記[18]。如Ty-1、Ty-2和Ty-3/Ty-3a基因的 SCAR標(biāo)記,這些分子標(biāo)記在抗感品系間均表現(xiàn)出長(zhǎng)度多態(tài)性,能夠區(qū)分純合、雜合品系,成為與 TYLCV 抗性基因緊密連鎖的共顯性標(biāo)記,可以方便、快捷、可靠地檢測(cè)大量個(gè)體[19]。
本試驗(yàn)選用17份番茄材料,通過(guò)苗期人工接種黃化曲葉病毒,從病情指數(shù)、防御酶活性的變化、抗性基因的檢測(cè)三方面研究番茄材料對(duì)番茄黃化曲葉病毒病的抗性,為篩選和培育番茄黃化曲葉病毒病抗病番茄材料提供理論基礎(chǔ)。
供試的15份番茄育種材料由甘肅張掖益新泉蔬菜育種公司提供,編號(hào)分別為801、802、803、805、806、817、818、819、820、822、841、842、853、857、867。‘齊達(dá)利’(先正達(dá)種子公司提供)為陽(yáng)性對(duì)照,‘Money Maker’(MM)(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所鮮食番茄課題組提供)為陰性對(duì)照。用于苗期接種的 TY-DNA 侵染性克隆 pBin-PLUS-1.7A+2β(農(nóng)桿菌)引自浙江大學(xué)周雪平教授實(shí)驗(yàn)室。
1.2.1 番茄苗的培養(yǎng) 將以上17份番茄材料種子用10%次氯酸鈉溶液浸泡10 min,于2019年4月9日播種于50孔的育苗穴盤中,置于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)育苗基地培養(yǎng),當(dāng)番茄幼苗長(zhǎng)出1~2片真葉時(shí),將其定植于花盆中。
1.2.2 pBin-PLUS-1.7A+2β的培養(yǎng) 準(zhǔn)備含 Kan(50 mg/L)和 Rif(50 mg/L)的固體 LB 培養(yǎng)基和液體LB培養(yǎng)基,取含 pBin-PLUS-1.7A+2β的農(nóng)桿菌菌液,在固體LB培養(yǎng)基上涂板,靜置于28 ℃培養(yǎng)箱,倒置暗培養(yǎng),待長(zhǎng)出單菌落,挑取之于LB液體培養(yǎng)基中,200 r/min 28 ℃培養(yǎng),過(guò)夜搖菌。當(dāng)菌液 600 nm波長(zhǎng)處的吸光值達(dá)0.6~0.8時(shí),可用于注射接種。
1.2.3 接種病毒 接種前一天給幼苗澆足水,使葉片細(xì)胞吸水飽脹,便于注射侵染。接種時(shí)采用葉片人工注射接種。將容量為1 mL的注射器去除針頭,吸取菌液,番茄葉背壓力注射至可觀察到菌液滲入,每株 0.2 mL左右,每個(gè)番茄材料幼苗各接種20株。接種后20、30、40 d調(diào)查發(fā)病情況并取番茄葉組織,進(jìn)行苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性測(cè)定,試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。
1.3.1 番茄材料病情調(diào)查與分析 病情分級(jí)參照 Lapidot等[20]的抗性分級(jí)方法:0級(jí),植株正常生長(zhǎng);1級(jí),新葉輕微卷曲,發(fā)皺,其他正常;2級(jí),葉片一定程度上黃化,發(fā)皺;3級(jí),葉片大面積黃化卷曲,植株矮化;4級(jí),植株嚴(yán)重矮化,葉片卷曲黃化嚴(yán)重,植株停止生長(zhǎng)。根據(jù)通用的番茄病毒病群體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[21],分為免疫(I,不表現(xiàn)癥狀,病情指數(shù)為 0)、高抗(HR,0 < 病情指數(shù)≤2)、抗病(R,2 < 病情指數(shù)≤15)、中抗(MR,15 < 病情指數(shù)≤30)、感病(S,30 < 病情指數(shù)≤100)。病情指數(shù)計(jì)算參照以下公式:
病情指數(shù)(DI)=∑(發(fā)病株數(shù)×發(fā)病級(jí)數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)數(shù))×100%
病株率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù) ×100%
1.3.2 防御酶活性的測(cè)定 POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法;PPO 活性測(cè)定及PAL活性測(cè)定參照李翠丹等[22]的方法。
1.3.3 抗性基因的檢測(cè) 于2019年5月15日,分別取17份番茄材料的新鮮組織,用液氮速凍,用試劑盒方法提取葉片的總DNA,試劑盒購(gòu)自天根生物公司。用于番茄抗病基因檢測(cè)的引物一共有3對(duì),參考蔣振等[15]、Garcia等[23]、Ji 等[24],分別為Ty-1、Ty-2、Ty-3,由北京奧克鼎盛生物公司合成,引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表1。PCR體系為20μL ,其中模板DNA 1μL、Master Mix10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:94 ℃變性3 min后開(kāi)始循環(huán),94 ℃變性30 s,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,34個(gè)循環(huán)結(jié)束后,72 ℃繼續(xù)延伸 5 min。PCR產(chǎn)物于 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳 25 min(150V),最后用Goldview染色,凝膠成像系統(tǒng)拍照。
表1 抗性基因名稱、基因型及所需引物統(tǒng)計(jì)Table 1 Resistance gene name,genotype and required primer statistics
每組數(shù)據(jù)設(shè)定3個(gè)重復(fù),采用 Microsoft Excel(2016 版) 計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖,用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,并運(yùn)用 Duncan’s 檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。
從表2可以看出,隨著時(shí)間的推移,除免疫和高抗材料外,其他材料的病株率和病情指數(shù)均呈上升趨勢(shì),第20天到第30天上升趨勢(shì)最快并在第40天時(shí)達(dá)到峰值;接種第20天時(shí),805、817、819、820、841、842表現(xiàn)為高抗,853、857、867表現(xiàn)免疫,證明在感病初期對(duì)番茄黃花曲葉病毒病是有一定抗性的;接種第30天時(shí),感病材料病株率和病情指數(shù)上升明顯,801、802、806、822、陰性對(duì)照MM發(fā)病率和病情指數(shù)均較高,與其他材料有顯著性差異(P<0.01 ,P<0.05);接種第40天時(shí),大部分感病材料病株率和病情指數(shù)有緩慢上升并趨于平穩(wěn),感病情況較第30天時(shí)變化不大,證明在第40天時(shí)已經(jīng)充分發(fā)病。801、802、 803、806、822、陰性對(duì)照材料MM病株率和病情指數(shù)達(dá)到峰值,發(fā)病最為嚴(yán)重,與其他材料有顯著性差(P<0.01,P<0.05),是較為典型的感病品種。
表2 不同時(shí)期番茄材料病情調(diào)查結(jié)果Table 2 Investigation result of tomato materials in different periods
2.2.1 PAL活性與抗病性的關(guān)系 由圖1可以看出,801、805、817、818、820、842隨著時(shí)間的推移,酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)并在第30天時(shí)達(dá)到峰值;陽(yáng)性對(duì)照材料齊達(dá)利、802、803、806、819、822、841、853、857、867隨著時(shí)間的推移,酶活性則呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)并在第20天時(shí)達(dá)到峰值,說(shuō)明這些番茄材料在發(fā)病初期就啟動(dòng)了防御酶系統(tǒng);陰性對(duì)照材料MM酶活性隨著時(shí)間的推移則呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)并在第40天時(shí)達(dá)到峰值;陽(yáng)性對(duì)照材料‘齊達(dá)利’的酶活性同其他材料相比有顯著性差異(P<0.05)。
圖1 不同番茄材料苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性Fig.1 Phenylalaninase (PAL) activity of different tomato materials
2.2.2 PPO活性與抗病性的關(guān)系 由圖2可以看出,801、803、817、822、841、842隨著時(shí)間的推移,酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)并在30 d時(shí)達(dá)到峰值;陽(yáng)性對(duì)照材料齊達(dá)利、陰性對(duì)照材料MM、802、805、806、818、819、820、853、857、867、857、867隨著時(shí)間的推移,酶活性則呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)并在20 d時(shí)達(dá)到峰值;陽(yáng)性對(duì)照材料齊達(dá)利、857、867的酶活性同其他材料相比有顯著性差異(P<0.05)。
2.2.3 POD活性與抗病性的關(guān)系 由圖3可以看出,17份番茄材料隨著時(shí)間的推移,酶活性呈現(xiàn)逐步降低的趨勢(shì)并在20 d時(shí)達(dá)到峰值,陽(yáng)性對(duì)照材料齊達(dá)利的酶活性同其他材料相比有顯著性差異(P<0.05)。
圖2 不同番茄材料多酚氧化酶(PPO)活性Fig.2 Polyphenol oxidase (PPO) activity of different tomato materials
圖3 不同番茄材料過(guò)氧化物酶(POD)活性Fig.3 Peroxidase (POD) activity of different tomato materials
由圖4可知,對(duì)17份番茄材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,818、820、853、857、867和‘齊達(dá)利’擴(kuò)增出約750 bp的條帶,均為純合顯性材料Ty-1/Ty-1。801、802、803、805、806、817、819、822、841、842擴(kuò)增出約630 bp的條帶,均為純合隱性材料Ty-1/Ty-1。MM不含Ty-1基因;801、802、803、805、806、817、818、819、820、841、842、853、857、867和‘齊達(dá)利’擴(kuò)增出約850 bp的條帶,均為純合隱性材料Ty-2/Ty-2。822和MM不含Ty-2基因;853、857、867擴(kuò)增出約450 bp的條帶,均為純合抗病材料Ty-3/Ty-3。 801、802、803、805、806、817、818、819、820、841、842擴(kuò)增出約320 bp的條帶,均為純合隱性材料Ty-3/Ty-3。陽(yáng)性對(duì)照材料‘齊達(dá)利’為雜合抗病材料Ty-3/Ty-3,陰性對(duì)照材料MM不含Ty-3基因。
a. Ty-1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; b. Ty-2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物; c. Ty-3/ Ty-3a PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;1-17.分別為番茄材料801、802、803、805、806、817、818、819、820、822、841、842、853、857、867、陽(yáng)性對(duì)照‘齊達(dá)利’及陰性對(duì)照MM;M.marker
近幾年,番茄黃化曲葉病毒病逐漸成為影響番茄產(chǎn)量的限制因素。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,在抗黃化曲葉病毒病抗性基因及其相關(guān)抗病機(jī)理方面取得的研究成果,為抗病育種方面提供了扎實(shí)的理論基礎(chǔ)[25]。
如何對(duì)番茄材料進(jìn)行客觀的抗性評(píng)價(jià)對(duì)選育新品種至關(guān)重要。本研究選用農(nóng)桿菌接種黃化曲葉病毒,對(duì)不同的番茄材料進(jìn)行病情指數(shù)調(diào)查、防御酶活性測(cè)定及抗性基因的檢測(cè)。結(jié)果表明,隨著時(shí)間的推移,除853、857、867對(duì)番茄黃化曲葉病毒毒病表現(xiàn)為免疫外,其他材料均不同程度的發(fā)病且病情指數(shù)呈上升趨勢(shì),與鄭積榮等[19]研究結(jié)論一致。對(duì)黃化曲葉病毒病表現(xiàn)為免疫的853、857、867均在接種后的初期防御酶活性達(dá)到峰值,說(shuō)明可能是由于早期防御反應(yīng)出現(xiàn)較早,酶促反應(yīng)速度快,催化誘導(dǎo)形成的酚類物質(zhì)積累早,而其他感病材料不同程度感病且峰值出現(xiàn)較晚,這與馬艷玲等[26]在黃瓜枯萎病抗性研究中得出的結(jié)論相同。而防御酶的啟動(dòng)作為植物抗病的一個(gè)表現(xiàn),在實(shí)際栽培中可根據(jù)發(fā)病高峰期到來(lái)的時(shí)間,合理安排施用化學(xué)藥物進(jìn)行防治。TYLCV 屬于雙生病毒,是一種重組極度頻繁的植物病毒[27],導(dǎo)致了該病毒極易發(fā)生變異,不同番茄材料所含抗性基因不同,其表現(xiàn)的抗性水平也不同[28-31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,只要含有抗性基因的材料,都表現(xiàn)出不同程度的抗性,而不含任何抗性基因的陰性對(duì)照材料MM發(fā)病率和病情指數(shù)則高于其他材料;對(duì)番茄黃化曲葉病毒病表現(xiàn)為免疫的853、857、867均含有純合的Ty-1、Ty-3基因,且Ty-1和Ty-3作為一對(duì)等位基因,被認(rèn)為是抗黃化曲葉病毒病的主效基因[32]。目前,中國(guó)育種工作者育成一些抗 TYLCV 的番茄品種。這些抗病品種一般也是基于Ty-1和Ty-3抗性基因[33]。因此在 TYLCV 為害嚴(yán)重的地區(qū)應(yīng)盡量選擇含純合Ty-1和Ty-3基因的品種進(jìn)行栽培。
本研究從表型、生理、分子水平分析17份番茄材料在不同抗病時(shí)期的抗病表現(xiàn)并對(duì)其所含的抗性基因進(jìn)行鑒定,篩選出3個(gè)免疫材料(853、857和867)和2個(gè)高抗材料(817和842),3個(gè)免疫材料均含有純合Ty-1、Ty-3基因且防御酶活性較其他材料高,峰值出現(xiàn)較早。番茄黃化曲葉病毒變異快,不同地區(qū)病毒種類有差異,在育種過(guò)程中還需培育多抗基因聚合品種,提高番茄對(duì)黃化曲葉病毒病的抗性,是番茄抗病育種中的一個(gè)重要研究目標(biāo)。