陳小康,李芳芳,王文斌,單衛(wèi)星,杜 羽

(1.西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌 712100；2.西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 712100)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是全球第四大重要糧食作物，同時在中國也是重要的蔬菜作物[1]。其營養(yǎng)價值高、適應性強、產量大，在人類生活中發(fā)揮著非常重要的作用，但是生物和非生物脅迫對馬鈴薯造成的損失仍然不容忽視。隨著中國市場對馬鈴薯的需求不斷增加，馬鈴薯產量的提升、農藝性狀的改良以及優(yōu)質品種的選育已成為馬鈴薯產業(yè)的戰(zhàn)略性目標。然而，由于栽培馬鈴薯屬于部分異源四倍體，雜合性高，利用常規(guī)雜交育種手段很難在較短時間內育成優(yōu)良品種，近年來人們試圖用基因工程技術對馬鈴薯品種進行農藝性狀改良。目前四倍體和二倍體的馬鈴薯遺傳轉化體系不斷被優(yōu)化，但是關于馬鈴薯的遺傳轉化仍然存在基因依賴性問題[2-3]，對馬鈴薯遺傳轉化體系的改良和優(yōu)化仍然是基因工程的重要技術改革。馬鈴薯遺傳轉化的改良和優(yōu)化包括載體的選擇和轉化方法的優(yōu)化，載體的選擇取決于基因的功能，一般對于基因功能的驗證包括過表達和基因沉默，本研究主要利用RNAi載體進行基因沉默，并獲得一種高效的馬鈴薯遺傳轉化體系。目前，在作物中借助RNAi載體并結合遺傳轉化驗證基因功能的報道有很多，例如李奇科等[4]構建了以PVY的CP為靶標的RNAi表達載體pROKY300，實現(xiàn)了馬鈴薯Y病毒CP基因在煙草中的沉默；安然等[5]利用RNAi表達載體pCEI-PFR，通過沉默馬鈴薯Sgt1-3基因來減少塊莖糖苷生物堿積累；水稻抗旱基因OsbHLH120RNAi干擾載體的構建及遺傳轉化為進一步研究OsbHLH120在水稻抗旱過程中的作用奠定基礎[6]。關于利用RNAi載體在馬鈴薯中的運用也有報道，如沉默馬鈴薯周皮層中StKCS6基因導致木栓質和蠟化合物的鏈長減少，同時增強表皮蒸騰作用；利用RNAi技術沉默馬鈴薯中的PVS基因，可以減少植物抗毒素的生成從而促進致病疫霉菌的侵染；RNAi介導的內源性Vlnv基因沉默可穩(wěn)定降低馬鈴薯冷誘導產生的甜味[7-9]。對馬鈴薯作物而言，目前發(fā)掘實用且高效的RNAi沉默系統(tǒng)和改良遺傳轉化體系仍然具有重要意義。

RNA沉默(RNA interference，RNAi)是指生物體內源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導的細胞內mRNA被特異性降解，導致靶標基因被沉默，從而產生相應的功能表型的缺失現(xiàn)象[10]。RNAi技術在植物體內應用廣泛，其原理為：將構建的RNAi植物表達載體導入植物體內，形成轉錄產物dsRNA(double stranded RNA，dsRNA)，然后dsRNA被植物體內的內切核酸酶Dicer切割成由正義和反義序列組成的，大小為21～25nt的干擾性小dsRNA(small interfering RNA, siRNA)，由siRNAs中的反義鏈指導形成RNA介導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)會特異性降解與siRNA同源的靶標mRNA，從而實現(xiàn)基因沉默[11]。

在植物中，MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)級聯(lián)途徑與生物及非生物脅迫響應、細胞分化和發(fā)育以及激素反應密切相關。MAPK 信號轉導由 MAPK 級聯(lián)反應逐級傳遞，在感受刺激后，上游的 MAPKKK 首先被磷酸化并特異激活 MAPKK，MAPKK 被激活后，緊接著磷酸化并激活下游的 MAPK，MAPK 被激活后可以磷酸化下游特定的轉錄因子或相關蛋白，并調節(jié)各類應答基因表達[12]。目前在植物中對于 MAPK 的研究報道較多，例如，AtMEKK1在水楊酸介導的防御反應中和活性氧穩(wěn)態(tài)的調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[13]，擬南芥 MKK1蛋白信號通路調節(jié)應答效應子的基因表達，并在病原體防御中發(fā)揮重要作用[14]。擬南芥mkk2突變體植株對鹽害的耐受性減弱，反之，過表達 MKK2的轉基因植株對鹽害的耐受性增加，表明擬南芥MKK2介導植物對冷害和鹽害的脅迫響應[15]。番茄SlMKK2和SlMKK4正調控番茄對灰葡萄孢的免疫反應[16]。棉花GhMKK1通過降低PR基因的表達水平負調控棉花對青枯菌的抗性[17]。目前關于MKK1基因在擬南芥、番茄、棉花、水稻、玉米作物中的作用均有報道[14-19]，但在馬鈴薯中還未報道，MKK1作為 MAPK 級聯(lián)反應的中間核心成員，在植物生長發(fā)育以及植物免疫調節(jié)中發(fā)揮著非常重要的作用。本研究通過克隆AtMKK1在馬鈴薯中的同源基因StMKK1，選定StMKK1保守且特異的靶序列，利用 RNA干擾技術，構建由 CaMV35S 啟動子驅動的內含“正向StMKK1靶標片段-pdk intron-反向StMKK1靶標片段”結構的 RNAi 植物表達載體，利用根癌農桿菌將其轉入馬鈴薯品種 Desiree 中，從而獲得沉默StMKK1基因的馬鈴薯轉基因植株。以期為馬鈴薯遺傳轉化體系優(yōu)化和技術改良提供新的思路和方法，同時為研究StMKK1在馬鈴薯生長發(fā)育和免疫調節(jié)中可能發(fā)揮的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

四倍體馬鈴薯栽培品種Desiree來自西北農林科技大學，組培苗于西北農林科技大學園藝學院組培間培養(yǎng)，MS30培養(yǎng)基配方為： 4.43 g·L-1MS(粉末購自美國Phytotech公司)+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂，培養(yǎng)條件為23 ℃ 16 h光照培養(yǎng)，光照度3 000 lx，16 ℃ 8 h黑暗培養(yǎng)。取苗齡大約5～7周生長健壯的無菌苗用于試驗。試驗所用激素：2, 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和激動素(Kinetine)均購自Phytotech公司，卡那霉素(Kanamycine)、萬古霉素(Vancomycine)和塞胞霉素(Cefotaxime)均購自索萊寶公司，萘乙酸(NAA)、6-芐基嘌呤(6-BA)、反式玉米素(trans-Zeatin-riboside)均購自Sigma公司。R3B培養(yǎng)基配方為：4.43 g·L-1MS+30 g·L-1蔗糖，pH調至5.8后用ddH2O定容，最后加入8 g·L-1Agar，121 ℃高壓滅菌30 min，待稍冷卻后加入2.0 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA；PACM液體培養(yǎng)基配方為：4.43 g·L-1MS+30 g·L-1蔗糖+2.0 g·L-1水解酪蛋白， pH調至6.5后用ddH2O定容，121 ℃高壓滅菌30 min，待稍冷卻后加入0.5 mg·L-1激動素和1 mg·L-12, 4-D；Zcvk固體培養(yǎng)基配方為： 4.43 g·L-1MS+20 g·L-1蔗糖，調pH至5.8后加入8 g·L-1Agar，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后加入100 mg·L-1卡那霉素、200 mg·L-1的塞胞霉素(Cefotaxime)、200 mg·L-1萬古霉素(Vancomycine)以及1.0 mg·L-1的反氏玉米素。500 mL LB培養(yǎng)基配方為： Trptone 5 g，yeast extract 2.5 g，NaCl 5 g，Agar 3.8 g(液體培養(yǎng)基不加瓊脂)，用ddH2O 定容，高壓滅菌后使用。

所用高保真酶Fast pfu DNA polymerase、DNA聚合酶EasyTaqDNA Polymerase、連接酶T4DNA Ligase、限制性內切酶(promega)：EcoRI、KpnⅠ、XbaⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、NotⅠ等。抗生素：鹽酸壯觀霉素、利福平霉素、慶大霉素、卡那霉素。瓊脂糖、hydragreen無毒核酸染料、DNA loading Buffer、DNA marker Ⅲ(購自天根生化科技有限公司)。PCR儀、電泳儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD)、藍光儀(TGreen Transilluminator Plus)電穿孔儀等。

試驗所用農桿菌的菌株為GV3101，大腸桿菌DH5α，所用載體為PKANNIBAL和植物表達載體pART27，均來自旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室。

1.2 方 法

1.2.1 RNAi載體構建 根據(jù) National Center for Biotechnology Information(NCBI)和茄科數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/)上公布的StMKK1序列信息，其GeneBank號為(XM_006353485.2)，利用 Bioedit和DNAMAN 6.0 軟件比對StMKK1與其他物種的保守區(qū)段，確定特異靶標序列，并利用 primer 5.0 軟件設計來自正向靶標序列的特異性引物StMKK1RNAi1EcoRI-F和StMKK1RNAi1KpnⅠ-R以及來自反向靶標序列的特異性引物StMKK1RNAi1XbaⅠ-F和StMKK1RNAi1HindⅢ-R，引物序列見表 1。載體構建部分參照李奇科等[4]的方法，以 Desiree 的 cDNA 為模板對正反向靶標序列進行克隆。反應程序： 95 ℃預變性 2 min；95 ℃變性 20 s，52 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 20 s，循環(huán) 35 次。在瓊脂糖凝膠中檢測，135 V恒壓30 min 電泳，使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD)拍照，利用膠回收試劑盒回收目的基因片段。以旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室已有的通過NotⅠ酶切位點連接的 PKANNIBAL和 pART27 雙元重組載體 35s-pART27 為基礎，將質粒 35s-pART27 進行HindⅢ和XbaⅠ雙酶切反應，與被HindⅢ 和XbaⅠ 雙酶切的StMKK1的反向靶標序列進行連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α，得到含有反向片段的重組克隆載體，測序正確后，命名為 35s-StMKK1R-pART27。然后對 35s-StMKK1R-pART27 進行EcoRI和KpnⅠ 雙酶切反應，與同樣進行EcoRI 和KpnⅠ 雙酶切的StMKK1的正向靶標序列進行連接，然后轉化大腸桿菌，最終得到反向重復序列的重組 RNAi 表達載體，測序正確后命名為35s-StMKK1-pART27-RNAi，然后將質粒轉化到 GV3101 的農桿菌菌株中。

1.2.2 農桿菌介導的馬鈴薯遺傳轉化 農桿菌的活化：取出-80 ℃冰箱凍存的含有質粒的GV3101農桿菌菌株，在含有Spec(壯觀霉素)、Gen(慶大霉素)和Rif(利福平霉素)抗性的LB平板上劃線；挑取菌落到2 mL液體LB(含Spec、Gen和Rif)，在水平搖床上200 r/min 28 ℃過夜培養(yǎng)。待OD達到0.5后收集菌液，利用離心機2 500 g離心10 min，加入與原菌液等體積的LB重懸菌體，得到細菌轉化液。提前24 h用手術刀切2～5 mm馬鈴薯莖段作為外植體，將其轉移到R3B培養(yǎng)基中，之后在培養(yǎng)皿中加入2 張無菌濾紙以及2 mL的液體PACM進行預培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為23 ℃， 16 h光照培養(yǎng)，光照度3 000 lx， 16 ℃ 8 h黑暗培養(yǎng))，然后將外植體轉移到細菌轉化液中，浸泡5～10 min后用無菌濾紙干燥，然后將其放回新的R3B培養(yǎng)基中，用封口膜封口，初步誘導愈傷組織，黑暗培養(yǎng)48 h后，將其轉到Zcvk培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導愈傷組織和芽分化。培養(yǎng)半個月后，更換新的Zcvk培養(yǎng)基，直到獲得轉基因植株。當誘導出芽后，將其轉移到帶有卡那抗性的MS30培養(yǎng)基中進行篩選鑒定。愈傷組織誘導率=形成愈傷的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%，芽誘導率=形成芽的愈傷數(shù)/形成愈傷的外植體數(shù)×100%，轉化率=形成芽的愈傷數(shù)/外植體總數(shù)×100%。

1.2.3 轉基因植株PCR檢測 參照Fan等[20]的方法，提取馬鈴薯擬轉化植株的基因組DNA。流程為：取葉片組織0.2 g，在液氮下磨碎至粉末狀，用干凈的藥勺轉移粉末到2 mL離心管，加入800 μL提前預熱的CTAB buffer?；靹蚝蠓胖?5 ℃水浴中保溫30～40 min，并不時輕輕搖動試管。冷卻至室溫后，加入約640 μL Tris-飽和酚(pH 8.0，含體積分數(shù)為1%的2-巰基乙醇)，顛倒混勻，室溫靜置10 min。加入160 μL氯仿，充分混勻后置于冰上5 min，然后12 000 g 4 ℃離心15 min，轉移上清至新的離心管(約1 mL)，緊接著加入640 μL的異丙醇，混勻，在-20 ℃沉淀 1 h以上，然后室溫12 000 g離心15 min，回收DNA沉淀。用體積分數(shù)為80%乙醇清洗DNA，室溫12 000 g離心5 min，棄去上清液，再次離心10 s，用槍頭移去殘留液后，置超凈工作臺中干燥約2 min，將DNA溶于20 μL ddH2O。取1 μL DNA作為模板進行PCR 檢測，并以特異引物StMKK1RNAi1KpnⅠ-R：5′-GGGGTACCTAGC- TCAGTAAGTGTTGCCAATG-3′和pKAN-F：5′-CAATCCCACTATC CTTCGCA-3′進行PCR 擴增，引物由北京奧科公司合成。PCR反應程序為：94 ℃預變性8 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30次。所用體系為： 0.5 μg·μL-1DNA 模板1 μL，10×EasyTaqbuffer 2.5 μL，引物各0.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL， EasyTaqDNA polymerase 0.2 μL ，用ddH2O定容至總體積25 μL。預期擴增片段大小為302 bp左右，以未轉化Desiree植株為陰性對照。擴增產物使用10 g·L-1瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.2.4 轉基因植株qRT-PCR檢測 植物總RNA提取完全參照Plant RNA Kit試劑盒說明書(貨號R6827-01)進行，完全按照TaKara公司反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT regent kit，貨號RR047A)說明書進行反轉錄。完全參照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(貨號為No.04913914001)說明書，以25 μL體系在Life Technologies公司生產的Q5實時定量PCR儀上進行反應和檢測。使用特異引物StMKK1-transgeneqpcr-F：5′-TTGCTAATCAATCACA-GAGGTG-3′和StMKK1-transgeneqpcr-R：5′-TGTCGCTTTTGTAATCATAGGC-3′。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結果與分析

2.1 35s- StMKK1-pART27-RNAi載體的獲得

利用StMKK1的正反向靶標序列的特異性引物分別擴增得到大小為302 bp的正向干擾片段和反向干擾片段(圖1-A)，將載體重組質粒35s-pART27進行XbaⅠ和HindⅢ雙酶切反應，與空質粒相比，酶切后的質粒條帶更大，證明載體已被線性化(圖1-B)，酶切后的35s-pART27與反向干擾片段連接并轉化，菌落PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后，得到300 bp左右的目標條帶，測序驗證后，獲得含有反向干擾片段的重組克隆載體，命名為35s-StMKK1R-pART27(圖1-C)，然后用EcoRI和KpnⅠ分別酶切正向干擾片段和35s-StMKK1R-pART27載體(圖1-D)并連接，進行菌落PCR檢測，結果顯示在瓊脂糖凝膠中出現(xiàn)300 bp左右大小的條帶(圖1-E)，提取重組表達載體送北京奧科公司測序，測序結果完全正確，得到含有反向重復序列的重組RNAi植物表達載體35s-StMKK1-pART27-RNAi。并創(chuàng)建35s-StMKK1-pART27-RNAi載體的結構簡圖(圖2)。

2.2 建立基于根癌農桿菌侵染馬鈴薯莖段的遺傳轉化體系

以馬鈴薯莖段作為外植體，在含有35s-StMKK1-pART27-RNAi質粒的細菌轉化液中，浸泡5～10 min(圖3-A)，完成侵染后用無菌濾紙進行外植體干燥，將其放回R3B培養(yǎng)基中用封口膜封口，黑暗培養(yǎng)48 h后，將其轉移到Zcvk培養(yǎng)基中(圖3-B)培養(yǎng)，每半月更換Zcvk培養(yǎng)基，直到獲得轉基因植株(圖3-C～圖3-F)。當誘導出芽后，將其轉到帶有卡那抗性的MS30培養(yǎng)基中進行篩選鑒定，經統(tǒng)計共切了90個莖段外植體，誘導出愈傷約為72個，分化不定芽約為53個，所用體系的愈傷誘導率可達80%，芽分化率可達74%。

2.3 馬鈴薯 StMKK1轉基因植株的鑒定

2.3.1 馬鈴薯轉基因植株的PCR檢測 隨機挑選經過卡那抗生素篩選的17株馬鈴薯轉化植株提取基因組DNA，以此為模板用pKAN-F和StMKK1RNAi1KpnⅠ-R引物進行PCR檢測，以未轉化的Desiree植株作為對照，結果顯示有16株轉基因苗擴增出302 bp左右的目標條帶，對照Desiree沒有擴增出目標條帶。初步證明StMKK1靶序列已整合到馬鈴薯的基因組中(圖4)。

A.目的基因的擴增，1～2. StMKK1正向和反向干擾序列擴增片段；B. 35s-pART27重組質粒的HindⅢ和XbaⅠ酶切檢測，1. 重組質粒35s-pART27，2～3.35s-pART27質粒被HindⅢ和XbaⅠ雙酶切后的條帶；C.連接反向干擾片段載體的菌落PCR檢測，1～5. 挑選的5個候選菌落；D.重組35s- StMKK1R-pART27質粒的EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切檢測，1.重組 StMKK1反向片段質粒35s- StMKK1R-pART27，2～3.35s- StMKK1R-pART27質粒被EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后的條帶；E.連接正向干擾片段的菌落PCR檢測，1～8.挑選的8個候選菌落； M.DNA marker Ⅲ

CaMV35S.35s啟動子；Noster.終止子；PDK Intron.丙酮酸磷酸雙激酶內含子；MCS.多克隆酶切位點；StMKK1F.StMKK1的正向干擾片段；StMKK1R.StMKK1的反向干擾片段

2.3.2 馬鈴薯轉基因植株的qRT-PCR檢測 將PCR鑒定結果為陽性的株系提取總RNA，反轉錄后以此為模板，對外源基因表達情況進行分析。以馬鈴薯的Stactin-7like基因(XM_006350963)作為內參基因，利用實時熒光定量PCR技術檢測馬鈴薯轉化植株葉片中StMKK1基因的表達量，結果表明：與未轉化的Desiree相比，StMKK1基因在轉基因植株(RNAi-2-RNAi12)中的表達量均顯著下降(其中RNAi-9植株除外)，降幅達到92%以上，與未轉化Desiree相比，RNAi-9植株中StMKK1基因的表達量沒有顯著差異，充分證明轉基因植株中StMKK1基因的表達基本都受到一定程度的干擾(圖5)。

A.馬鈴薯莖段剛接種；B.外植體轉移到Zcvk培養(yǎng)基誘導愈傷組織；C.轉移到Zcvk培養(yǎng)基誘導出不定芽；D.將芽轉移到MS30培養(yǎng)基誘根；E.生根；F.植株再生

M.DNA markerⅢ；CK.Desiree；1～20.轉基因植株的PCR擴增條帶

3 討 論

RNAi主要過程是dsRNA被內切核酸酶切割成21～25 nt的干擾性小RNA(siRNA)，同時由siRNA介導識別并靶向切割同源性靶mRNA分子。一般所用RNAi載體的基本構成就是在強組成型啟動子下游插入反向重復片段的重組雙元載體，是導致RNA沉默的基本結構，所建成的35s-StMKK1-pART27-RNAi就是采用在基因組中產生反向重復序列的轉錄產物，實現(xiàn)沉默StMKK1基因的目的。本研究利用pKANNIBAL載體兩個多克隆位點間的間隔序列構建尾尾相連而導致基因產生自我互補的hpRNA(分子dSRNA)結構。RNAi沉默載體中反向重復序列結構中的間隔序列可以是任一段核酸，據(jù)相關試驗證明[21]，間隔序列為內含子的反向重復序列，具有良好的穩(wěn)定性，更有利于dsRNA的產生和RNA沉默的誘導。

StMKK1在野生型Desiree和8個獨立的轉基因植株中的表達水平

近些年來，隨著CRISPR-Cas9定點基因編輯技術在植物中的應用，由于其可以進行基因敲除(單個基因敲除，多基因敲除以及大片段缺失)以及精確的堿基編輯，轉錄激活和轉錄抑制，逐漸成為人們使用的熱門技術[22]。在擬南芥、小麥、高粱、煙草、水稻、玉米、苔蘚植物以及地錢等植物中實現(xiàn)了定點基因組編輯的成功應用[23]。但是在馬鈴薯上應用的報道較少，一方面可能是由于馬鈴薯是四倍體，基因組信息復雜，數(shù)據(jù)庫信息不完整可能容易脫靶，另外一方面就是馬鈴薯CRISPR-Cas9體系仍然需要改進和優(yōu)化，使其具有廣譜性。目前很多學者在馬鈴薯上進行遺傳轉化仍然使用RNAi干擾技術。本研究利用RNAi干擾技術對StMKK1基因在馬鈴薯中進行沉默，獲得了高達92%以上的沉默效率，故所使用的RNAi載體具有高程度的干擾效率。

關于馬鈴薯遺傳轉化體系的報道有很多，如在Desiree中穩(wěn)定表達StMYB44，通過抑制StPHO1的表達來負調控馬鈴薯中的Pi轉運[24]。在馬鈴薯中過表達轉化PiSIF3可以顯著促進致病疫霉的侵染[25]。辛翠花等[26]以Desiree的葉片和莖段為外植體，獲得了具有抗晚疫病功能的馬鈴薯轉基因植株。使用artificial microRNA技術在馬鈴薯中沉默CBP80/ABH1基因，提高馬鈴薯的抗旱性[27]。但是關于馬鈴薯遺傳轉化體系，不同的實驗室體系有差異，其轉化條件也不一樣。即使同一材料的遺傳轉化方法也是有差異的，一般認為馬鈴薯的遺傳轉化效率受植物的基因型、農桿菌菌株類型、外植體類型、激素配比、侵染時間、共培養(yǎng)時間、農桿菌菌液濃度等因素的影響。辛翠花等[26]研究發(fā)現(xiàn)，以馬鈴薯葉片作為外植體，愈傷誘導率為60%，芽分化率為50%，遺傳轉化效率為30%，明顯低于本研究以莖段作為外植體所獲得的80%愈傷誘導率和74%的芽分化率以及59%的遺傳轉化效率。而裴瑞芳等[28]以馬鈴薯試管薯作為侵染材料，同樣獲得馬鈴薯的轉化植株，證實馬鈴薯的多個組織均可以被用作侵染材料從而獲得轉化植株。安然等[5]以馬鈴薯品種‘莊薯3號’和Favorita 組培苗作為侵染材料，以莖段作為外植體，利用農桿菌介導的方法，所用激素與本研究大致相同，獲得了60.23%的芽分化率，而本研究以四倍體栽培種Desiree組培苗作為侵染材料，獲得了74%的芽分化率，但獲得轉化植株從宏觀角度顯示馬鈴薯品種不同轉化效率也是不一致的。本研究利用常規(guī)的農桿菌介導方法，以莖段作為外植體，農桿菌的侵染濃度為OD=0.5，侵染時間為7 min，PACM培養(yǎng)基用來輔助侵染和預培養(yǎng)，利用R3B培養(yǎng)基誘導愈傷組織，Zcvk培養(yǎng)基誘導芽分化。轉化周期為90 d左右，經統(tǒng)計誘導出愈傷約為72個，分化不定芽約為53個，所用體系的愈傷誘導率可達80%，芽分化率可達74%，轉化率可達59%。所以本研究所用的馬鈴薯轉化體系效率是較高的。

本研究轉化了一個馬鈴薯絲裂原活化蛋白激酶StMKK1，關于MKK蛋白在生物和非生物脅迫中的研究有很多，MAPKK可以被上游的促絲裂原活化蛋白質激酶激酶激酶(MAPKKK)磷酸化其保守區(qū)域中絲/蘇氨酸殘基從而激活MAPKK，同時也可以磷酸化下游MAPK第七和第八亞結構域之間的絲/蘇氨酸和酪氨酸殘基從而激活MAPK[29]，在植物生長發(fā)育和植物免疫調控過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究通過農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得StMKK1的轉基因植株，為后期解析其調控植物免疫機制奠定基礎。

4 結 論

本研究以Desiree莖段作為外植體，構建融合StMKK1基因反向重復序列的RNAi表達載體，采用農桿菌侵染的遺傳轉化方法，獲得了馬鈴薯絲裂原活化蛋白激酶StMKK1沉默的轉基因馬鈴薯植株。qRT-PCR檢測結果表明，在馬鈴薯轉基因植株中，StMKK1基因表達量的降幅大于92%。研究結果為進一步研究StMKK1基因在馬鈴薯響應脅迫和信號轉導中的作用奠定基礎。