張 波，張 杰，張 顏，梁 燕

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

番茄(SolanumlycopersicumL.)是世界上栽培和消費(fèi)最廣泛的蔬菜作物之一。在番茄生產(chǎn)過程中，花期調(diào)控與果實(shí)發(fā)育至關(guān)重要，其與產(chǎn)量、熟性等密切相關(guān)。赤霉素(GA)是一類重要的植物激素，其在植物開花誘導(dǎo)和果實(shí)發(fā)育過程起著重要作用[1-4]。

隨著GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中幾個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子的鑒定和功能分析，人們對GA調(diào)控植物生長發(fā)育的分子機(jī)制有了較為深入的認(rèn)識[5-8]。GID1(GIBBERELLIN-INSENSITIVE DWARF1)是GA的受體，其能感知GA信號；DELLA蛋白屬于GA信號和植物生長發(fā)育的關(guān)鍵抑制因子，而GA促進(jìn)植物的生長發(fā)育是通過降解DELLA蛋白來完成的[9]。在GA信號傳導(dǎo)途徑中，具有生物活性的GA首先結(jié)合GID1受體，然后與DELLA蛋白相互作用，形成GA-GID1-DELLA三元復(fù)合體[9-11]，最后該復(fù)合體通過泛素化途徑使DELLA蛋白發(fā)生水解，消除DELLA的抑制作用，并誘導(dǎo)DELLA下游基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物生長發(fā)育[12-16]。例如，DELLA蛋白在植物成花過程中會抑制一些開花誘導(dǎo)基因的表達(dá)，而GA促使其快速降解，最終促成花轉(zhuǎn)變[17-20]。

GAMYB是GA信號途徑中的正向調(diào)節(jié)因子，屬于DELLA蛋白的下游基因。GAMYB最初是從大麥糊粉層中分離出來的，可以誘導(dǎo)許多GA響應(yīng)基因的表達(dá)[21-23]。近年來，多項(xiàng)研究表明GAMYB在GA調(diào)控植物花發(fā)育的過程中起著關(guān)鍵作用[1]。例如，毒麥LtGAMYB主要在莖尖表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄水平在開花誘導(dǎo)期間與GA含量同時(shí)上調(diào)，表明GA可能通過GAMYB的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來誘導(dǎo)植物開花[24]。擬南芥中有3個(gè)GAMYB基因：AtMYB33、AtMYB65和AtMYB101[24-25]。擬南芥從短日照條件轉(zhuǎn)移到長日照條件或在短日照下經(jīng)外源GA處理均誘導(dǎo)開花，與此同時(shí)，AtMYB33和花分生組織屬性基因LEAFY(LFY)在莖尖的表達(dá)水平上升，且AtMYB33的表達(dá)模式與LFY在莖尖重疊，但表達(dá)時(shí)間先于LFY[26-27]。此外，AtMYB33可以與LFY啟動子中一個(gè)特定的8-bp序列結(jié)合[28]，表明GAMYB可通過LFY基因的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控植物開花[28-29]。

目前，雖然GAMYB在調(diào)控植物開花方面的功能研究已取得了較大進(jìn)展[8,30-37]，但其在番茄中的功能尚不清楚。另外，GAMYB調(diào)控果實(shí)發(fā)育的研究較少，難以理解其在GA調(diào)控果實(shí)發(fā)育中的作用和機(jī)制。筆者實(shí)驗(yàn)室鑒定了番茄中的一個(gè)GAMYB同源基因SlMYB33，并進(jìn)行了初步分析，SlMYB33基因定位在6號染色體上，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，CDS序列全長1515bp，編碼504個(gè)氨基酸。SlMYB33氨基酸序列中包含1個(gè)R2R3重復(fù)序列和2個(gè)GAMYB家族特有的保守元件，證明SlMYB33屬于GAMYB家族，但對其功能的探討還非常有限。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，首先通過GUS組織化學(xué)染色對SlMYB33的表達(dá)進(jìn)行分析；其次通過該基因在番茄中的過量表達(dá)分析其生物學(xué)功能，旨在了解GAMYB家族在番茄中是否具有保守或特異的作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 以西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄育種課題組保存的Micro-Tom和哥倫比亞生態(tài)型(Col)擬南芥為研究材料。Micro-Tom種植在組培室內(nèi)，白天25 ℃，夜間18 ℃；擬南芥Col種植在光照培養(yǎng)箱內(nèi)，白天22 ℃，夜間 16 ℃；光周期為光照16 h/黑暗8 h。

1.2 方 法

1.2.1 GUS組織化學(xué)染色 克隆SlMYB33的啟動子序列，將其替換pBI121載體的35S啟動子，構(gòu)建pSlMYB33∶GUS融合表達(dá)載體。利用蘸花法將融合載體轉(zhuǎn)入到擬南芥Col中[38]，經(jīng)PCR鑒定獲得陽性植株。選取轉(zhuǎn)基因植株的花序，置于X-Glu溶液中染色過夜(37 ℃、避光)，然后在脫色液(乙醇和乙酸體積比為 3∶1)中脫色約3 h，其間適時(shí)更換脫色液。脫色之后在體視顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.2 過量表達(dá)載體構(gòu)建 過表達(dá)載體選擇的是pCAMBIA2307載體。用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ對pCAMBIA2307載體以及pMD18-T-SlMYB33進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，用T4連接酶連接載體片段和回收基因片段，連接過夜后轉(zhuǎn)入DH5α中，37 ℃培養(yǎng)，挑取單斑，進(jìn)行菌落PCR，選擇符合目的條帶的菌液進(jìn)行測序。

1.2.3 番茄遺傳轉(zhuǎn)化 將構(gòu)建好的SlMYB33過表達(dá)載體通過電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，然后利用筆者課題組已建立的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行轉(zhuǎn)化：農(nóng)桿菌侵染5 min，共培養(yǎng)1.5～2.0 d，通過抗生素和分化培養(yǎng)基進(jìn)行陽性芽篩選，3～4 d后長出2～5 mm的不定芽移栽生根培養(yǎng)基，之后進(jìn)行煉苗得到轉(zhuǎn)基因植株。分化培養(yǎng)基：MS + ZT(2 mg/L) + Kan (50 mg/L) + IAA (0.2 mg/L) +6-BA(2 mg/L) + CB (400 mg/L)；生根培養(yǎng)基：1/2 MS + IAA (0.2 mg/L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlMYB33在花和果實(shí)中的表達(dá)特征分析

為預(yù)測SlMYB33基因的生物學(xué)功能，首先對其表達(dá)特征進(jìn)行分析。構(gòu)建 pSlMYB33∶GUS融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入擬南芥中，然后利用GUS組織化學(xué)染色觀察該基因在花和果實(shí)中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1)，與對照相比轉(zhuǎn)基因植株的雄蕊和柱頭被染成藍(lán)色，說明SlMYB33主要在雄蕊和柱頭中表達(dá)。

A. SlMYB33在野生型擬南芥中的GUS組織化學(xué)分析；標(biāo)尺=2 mm，下同；B. SlMYB33在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的GUS組織化學(xué)分析

2.2 SlMYB33過表達(dá)載體的構(gòu)建

提取番茄花的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，用設(shè)計(jì)好的引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌落PCR檢測和雙酶切驗(yàn)證。菌液1～5的PCR擴(kuò)增條帶與陽性對照一致，均為1 500 bp左右(圖2-A)；雙酶切結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒可被酶切成1 500 bp和 6 000 bp的條帶，其中1 500 bp為目的基因長度(圖2-B)。最后根據(jù)測序結(jié)果確定SlMYB33過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A. SlMYB33過表達(dá)載體的菌液PCR鑒定；M.DNA 分子標(biāo)記，下同；pCAMBIA2307- SlMYB33質(zhì)粒為陽性對照 (+)；野生型DNA做陰性對照 (-)；泳道1～5.重組質(zhì)粒菌落PCR；B. SlMYB33過表達(dá)載體的雙酶切驗(yàn)證；CK.pCAMBIA2307- SlMYB33質(zhì)粒；1～2.雙酶切驗(yàn)證

2.3 SlMYB33過表達(dá)番茄植株的鑒定

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將SlMYB33過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入番茄中，通過PCR鑒定篩選陽性植株。如圖3-A所示，鑒定出11個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)一步對轉(zhuǎn)基因株系中的SlMYB33表達(dá)進(jìn)行檢測。qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系OE3、OE4、OE5、OE6、OE7中的SlMYB33表達(dá)顯著上調(diào)(圖3- B)，其中在OE4、OE5、OE7中的表達(dá)量均為WT的 10倍以上，因此選擇這3個(gè)株系進(jìn)行下一步 分析。

A. SlMYB33過表達(dá)株系的PCR鑒定；M.DNA 分子標(biāo)記；野生型DNA做陰性對照(-)；泳道1～11.植株P(guān)CR鑒定結(jié)果；B.轉(zhuǎn)基因植株中的 SlMYB33的表達(dá)分析；星號表示過表達(dá)株系和野生型之間的顯著差異(* P<0.05，** P<0.01；Student’s t-test), 下圖同

2.4 SlMYB33過量表達(dá)對番茄開花時(shí)間的 影響

鑒于其他作物GAMYB對開花的影響，筆者統(tǒng)計(jì)了SlMYB33過表達(dá)T1代植株的開花時(shí)間，發(fā)現(xiàn)OE4、OE5、OE7株系的始花節(jié)位為6～9，顯著大于野生型的4.7(圖4-B)，表明SlMYB33過量表達(dá)導(dǎo)致番茄開花延遲；與之對應(yīng)的是，SlMYB33過表達(dá)株系中第一朵花開放時(shí)間同樣推遲，如OE4和OE7播種后52～61 d第一朵花開放，明顯長于野生型的43.7 d (圖4-A，C)。

A.野生型和 SlMYB33過表達(dá)株系T1代。標(biāo)尺=10 cm;B.野生型和 SlMYB33過表達(dá)株系T1代的始花節(jié)位統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，下圖同；C.野生型和 SlMYB33過表達(dá)株系T1代中第一朵花開放時(shí)間

2.5 SlMYB33過量表達(dá)對番茄果實(shí)發(fā)育的影響

為進(jìn)一步了解SlMYB33是否影響番茄果實(shí)發(fā)育，對SlMYB33過表達(dá)株系中的果實(shí)表型進(jìn)行分析(圖5-A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OE4、OE5、OE7株系的成熟果實(shí)橫徑為 23.16～26.20 mm，縱徑為20.54～22.03 mm，顯著大于野生型的橫徑 16.17 mm、縱徑15 mm(圖5-B)，表明SlMYB33的上調(diào)可促使番茄果實(shí)增大。

A. SlMYB33-OE系果實(shí)顯著大于野生型。標(biāo)尺=1 cm；B.果實(shí)橫縱徑

3 討論與結(jié)論

GAMYB是GA信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組成部分，其在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用。目前，關(guān)于GAMYB的研究主要集中在種子萌發(fā)[1,40]、開花誘導(dǎo)[28-29,37,41]和花器官發(fā)育[22-23,30,35-36]等方面。本研究初步鑒定了番茄中GAMYB同源基因SlMYB33的功能，發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)控番茄的開花時(shí)間(圖4)，說明GAMYB在不同作物間具有保守功能[28-29,37,41-43]。此外，本試驗(yàn)還揭示了SlMYB33對番茄果實(shí)大小的影響(圖5)，為進(jìn)一步探討GAMYB在植物果實(shí)發(fā)育方面的作用奠定了基礎(chǔ)。

GAMYB是植物開花誘導(dǎo)的促進(jìn)因子[24]，而SlMYB33在番茄中的過量表達(dá)卻推遲開花(圖4)，推測SlMYB33對開花時(shí)間的影響存在劑量效應(yīng)，即SlMYB33的過量會起到反效果。這種生物學(xué)現(xiàn)象在其他物種中同樣出現(xiàn)，例如，大麥HvGAMYB的超量表達(dá)抑制了雄蕊發(fā)育，類似于GA過量對雄蕊的影響[6,23,44]。

前人研究表明，在GAMYB調(diào)控植物開花過程中，LFY是其下游目標(biāo)基因，即GAMYB通過激活LFY的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)植物開花[28,45-46]。番茄中Falsiflora(FA)是LFY同源基因，其功能缺失突變體表現(xiàn)為開花延遲表型[46]。因此推測，番茄FA有可能是SlMYB33的下游靶基因。總之，盡管SlMYB33對番茄開花具有非常重要的作用，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

此外，前人對于GAMYB調(diào)控植物開花和花發(fā)育的作用機(jī)制有了較為深入的研究，但在果實(shí)發(fā)育調(diào)控方面涉及較少。而本研究初步證實(shí)了SlMYB33在番茄果實(shí)大小調(diào)控中的作用，但目前對其調(diào)控機(jī)制的探討有待進(jìn)一步挖掘。番茄果實(shí)大小受到一系列基因的調(diào)控，如FW2.2、FW11.3、OVATE、SUN、FASCIATED(FAS)和LOCULENUMBER(LC)等[47-56]，而SlMYB33與這些基因是否存在調(diào)控關(guān)系以及如何調(diào)控將是揭示SlMYB33調(diào)控番茄果實(shí)大小分子機(jī)制的關(guān)鍵。

綜上，本研究初步分析了番茄中GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子SlMYB33的表達(dá)模式和生物學(xué)功能，證明其在番茄開花和果實(shí)發(fā)育中的作用。下一步將通過定點(diǎn)基因編輯技術(shù)獲得SlMYB33的功能缺失突變體，對該基因的功能在花和果實(shí)發(fā)育等方面進(jìn)行深入研究，同時(shí)篩選鑒定其上下游調(diào)控基因，對SlMYB33調(diào)控番茄生長發(fā)育的分子機(jī)理展開研究。