高 鵬，雒艷萍，李俊峰

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院傳染病研究室，蘭州 730000； 2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，蘭州 730000)

乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體病理性免疫損傷、特別是與以T淋巴細(xì)胞及其亞群介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答密切相關(guān)。乙型肝炎病毒在我國(guó)以B基因型和C基因型為主，B/C基因型的乙型肝炎病毒的發(fā)病機(jī)制有很大差別，但是目前很少有文獻(xiàn)探討在不同免疫階段B/C基因型乙型肝炎病毒感染的人體中T淋巴細(xì)胞及其亞群表達(dá)譜的差異，本文就此進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

分層隨機(jī)選取2016年1月至2017年12月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院門診和住院的確診為慢性乙型肝炎的患者375例，男260例，女115例，年齡18～60歲,所選患者病例完整。經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析后，確定慢性乙型肝炎攜帶者并且丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminetransferase ALT)正常的124例 (ALT<40 U/L)， 其中B基因型61例，C基因型63例；ALT≥正常上限，且<2倍增高的慢性乙型肝炎患者127例 (40 U/L≤ALT<80 U/L)， 其中B基因型65例，C基因型62例；ALT大于等于正常上限2倍增高的慢性乙型肝炎患者124例 (ALT≥80 U/L)，其中B基因型63例，C基因型61例,各組B/C基因型的病毒載量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別觀察在不同組別中B/C基因型的乙型肝炎病毒對(duì)T淋巴細(xì)胞總數(shù)、輔助/抑制性T淋巴細(xì)胞(T helper /inhibition lymphocyte，Th/i)、抑制/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (T inhibition/cytotoxic lymphocyte, Ti/c)、輔助性/細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(T helper / cytotoxic lymphocyte, Th/c)，以及血清中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、IL-4 和IL-10的影響。慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2010年慢性乙型肝炎防治指南《病毒性肝炎防治方案》[1]。同時(shí)排除妊娠期婦女、中度和重度脂肪肝患者、酒精肝患者、藥物性肝損傷患者、自身免疫性肝損傷患者、曾經(jīng)接受過抗病毒治療的患者，以及合并其他肝炎感染的患者和并發(fā)其他心血管、腎臟等重大臟器病變患者。研究對(duì)象包括患者和健康人均簽署知情同意書，本試驗(yàn)獲得蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器和試劑

熒光定量PCR分析儀購自德國(guó) Lightcycler ROCH公司；流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)及配套試劑購自美國(guó)BD公司；AU400型全自動(dòng)生化分析儀購自日本OLYMPUS公司；XE2100型全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自日本SYSMEX公司。

乙型肝炎抗原和抗體定量檢測(cè)試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，乙型肝炎病毒DNA檢測(cè)試劑盒、乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑盒均購自深圳匹基生物工程有限公司，IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10細(xì)胞因子檢測(cè)盒均購自晶美生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

乙型肝炎抗原和抗體定量檢測(cè)：采集患者靜脈血并分離血清，按化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的操作步驟進(jìn)行樣本檢測(cè)。

乙型肝炎病毒DNA檢測(cè)：采集患者靜脈血并分離血清，按乙型肝炎病毒 DNA 定量檢測(cè)試劑盒和基因擴(kuò)增儀的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)，敏感度>500 copies/mL。

乙型肝炎病毒基因分型：采集患者靜脈血并分離血清，按乙型肝炎病毒基因分型檢測(cè)試劑盒和基因擴(kuò)增儀的操作步驟進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)。

外周血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)：無菌操作采集靜脈血 2～3 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，用XE2100型全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀進(jìn)行淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)。

CD3、CD4、CD8 單抗標(biāo)記的制備：取100 μL 乙二胺四乙酸二鉀抗凝血加 20 μL 三色單克隆抗體(抗CD3 PE-CY5/抗CD4-FITC/抗CD8-PE)，陰性對(duì)照取 100 μL EDTA-K2 抗凝血加20 μL鼠抗人 IgG-PE-CY5/IgG-FITC/IgG-PE，混勻，室溫放置20 min。加入Muti-Q-Prep 溶血儀處理，每份標(biāo)本均設(shè)定測(cè)定管和陰性對(duì)照管。

淋巴細(xì)胞分類檢測(cè)：用流式細(xì)胞儀 (FACS Calibur)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面表達(dá)的 CD3、CD4及 CD8，結(jié)果以百分率(%)表示。

細(xì)胞因子檢測(cè)：采集患者靜脈血并分離血清，按IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10檢測(cè)試劑盒的操作步驟進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同免疫階段的B/C基因型乙型肝炎病毒對(duì)慢性乙型肝炎患者T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響是不相同的，由結(jié)果可見,在ALT正常組中，B/C基因型乙型肝炎病毒對(duì)T淋巴細(xì)胞及其亞群無明顯區(qū)別，而在ALT異常組中，B/C基因型的乙型肝炎病毒對(duì)T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響有明顯區(qū)別，且以ALT≥正常上限2倍組中為甚，具體表現(xiàn)為在ALT≥正常上限、且小于2倍增高的慢性乙型肝炎患者組中，反映Th1型淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ,C基因型組中較B基因型組中有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其他指標(biāo)差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在ALT≥正常上限2倍增高的慢性乙型肝炎患者組中，B/C基因型乙型肝炎病毒對(duì)T淋巴細(xì)胞及其亞群有明顯影響。T淋巴細(xì)胞總數(shù)、Th/i淋巴細(xì)胞在C基因型中較B基因型少，Ti/c淋巴細(xì)胞在C基因型中較B基因型多，Th/c比值在C基因型中較B基因型下降明顯，C基因型甚至出現(xiàn)倒置。在Th細(xì)胞亞群方面，反映Th1型細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ，C基因型中較B基因型中明顯升高，而反映Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-4、IL-10，C基因型中較B基因型中明顯下降(表1～3)。

3 討論

乙型肝炎病毒已發(fā)現(xiàn)有A～I(xiàn) 9個(gè)基因型，在我國(guó)以C基因型和B基因型為主。乙型肝炎病毒基因型和疾病進(jìn)展及干擾素治療效果有關(guān)，與C基因型感染者相比，B基因型感染者較早出現(xiàn)乙型肝炎e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換，較少進(jìn)展為肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌，并且乙型肝炎e抗原陽性患者對(duì)干擾素治療的應(yīng)答率高于C基因型[2-3]，但是其原因鮮見探討。同時(shí)慢性乙型肝炎患者可處于不同的病變階段，具體分為免疫耐受期、免疫清除期、非活動(dòng)或低 (非) 復(fù)制期以及再活動(dòng)期，在不同階段，免疫反應(yīng)是不同的[4-5]，可表現(xiàn)為免疫耐受和免疫應(yīng)答。當(dāng)機(jī)體處于免疫耐受狀態(tài)，機(jī)體不發(fā)生免疫應(yīng)答，多成為無癥狀攜帶者，ALT水平正常，肝組織學(xué)無明顯異常并可維持?jǐn)?shù)年甚至數(shù)十年。但當(dāng)機(jī)體處于免疫應(yīng)答狀態(tài)時(shí)，常伴有ALT持續(xù)或間歇升高，肝組織學(xué)中度或嚴(yán)重炎癥壞死，肝纖維化可快速進(jìn)展，部分患者可發(fā)展為肝硬化和肝衰竭[4,6]。同時(shí)臨床上又經(jīng)常以ALT≥2倍正常上限作為抗病毒治療的一個(gè)常用標(biāo)準(zhǔn)，因此本研究以此為節(jié)點(diǎn)，分析不同ALT狀態(tài)下病毒載量與機(jī)體免疫反應(yīng)的關(guān)系。乙型肝炎病毒感染人體后，機(jī)體主要依靠細(xì)胞毒效應(yīng)與非細(xì)胞毒效應(yīng)兩種免疫機(jī)制清除病毒，其中T淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞毒效應(yīng)起主導(dǎo)作用[7-8]，T淋巴細(xì)胞依據(jù)表面分化抗原分為CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞中的 CD4+細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)特異性B細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞成熟和增殖，具有較強(qiáng)的抗病毒效應(yīng)，CD8+細(xì)胞通過細(xì)胞溶解或非溶解機(jī)制來清除病毒。Th細(xì)胞又依據(jù)分泌細(xì)胞因子的不同分為Th1亞群和Th2亞群，同時(shí)有文獻(xiàn)顯示在乙型肝炎病毒感染機(jī)體后出現(xiàn)Th細(xì)胞亞群的異常[9-10]，但是目前鮮見有文獻(xiàn)探討在不同免疫階段不同基因型的乙型肝炎對(duì)T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響。本研究主要通過比較分析不同基因型的乙型肝炎病毒在不同免疫階段其T淋巴細(xì)胞和亞群的差別，來探討B(tài)/C基因型的乙型肝炎病毒對(duì)患者臨床表現(xiàn)及治療預(yù)后差別的重要原因。

表2 ALT≥正常上限、且<2倍增高的慢性乙型肝炎患者組中B/C基因型的免疫功能狀態(tài)(n=127)Table 2 Immune function in ALT greater than or equal to the upper limit of normal, and less than 2 times higher than the upper limit of normal type B and type C genotypes chronic hepatitis B patients (n= 127)

表3 ALT≥正常上限2倍增高的慢性乙型肝炎患者組中B/C基因型的免疫功能狀態(tài)(n=124)Table 3 Immune function in ALT greater than or equal to 2 times higher than the upper limit of normal type B and type C genotypes chronic hepatitis B patients (n= 124)

本研究結(jié)果顯示在不同免疫階段B/C基因型乙型肝炎病毒對(duì)慢性乙型肝炎患者T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響是不相同的。在ALT正常組中，B/C基因型乙型肝炎病毒對(duì)T淋巴細(xì)胞及其亞群無明顯區(qū)別，這可能是因?yàn)樵诖穗A段機(jī)體大致處于免疫耐受階段，病理性的免疫反應(yīng)尚不強(qiáng)烈，即使乙型肝炎病毒基因型不同，它們引起的病理性免疫反應(yīng)尚無明顯差別[9]，而在ALT異常組中，B/C基因型的乙型肝炎病毒對(duì)T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響有明顯區(qū)別，且以ALT≥正常上限2倍組中為甚。據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)推測(cè)認(rèn)為，機(jī)體感染乙型肝炎病毒后，會(huì)引起機(jī)體免疫功能的紊亂，結(jié)合本研究結(jié)果認(rèn)為機(jī)體感染乙型肝炎病毒后，特別是在免疫應(yīng)答階段，T淋巴細(xì)胞下降，并且以C基因型為甚，這說明C基因型乙型肝炎病毒感染人體后對(duì)機(jī)體有一定的免疫抑制作用，特別是對(duì) CD4+T淋巴細(xì)胞有一定抑制作用，這點(diǎn)也說明C基因型乙型肝炎病毒感染人體后病毒很難被清除，因而引起的病理損傷較B基因型強(qiáng)烈[11]。在免疫應(yīng)答階段，B/C基因型的乙型肝炎病毒對(duì) CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的研究結(jié)果提示乙型肝炎病毒感染機(jī)體后引起 Th1、Th2細(xì)胞之間的不平衡，Th1、Th2應(yīng)答之間的平衡是維持正常免疫反應(yīng)的重要環(huán)節(jié), 在清除病毒和腫瘤、誘導(dǎo)免疫耐受等方面起著關(guān)鍵性作用[10]。本研究中反映Th1細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ在C基因型中較B基因型中明顯升高，Th1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與病毒清除有關(guān)，并同時(shí)與肝組織的病理損傷相關(guān)，據(jù)此推測(cè)Th1細(xì)胞的增高導(dǎo)致C基因型乙型肝炎病毒感染人體后較B基因型病情發(fā)展迅速，且難以治療，而反映Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-4、IL-10，在C基因型中較B基因型明顯下降。Th2細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能抑制 Th1細(xì)胞的分化，導(dǎo)致乙型肝炎病毒感染的慢性化，又有利于防止 Th1細(xì)胞應(yīng)答過度而造成的病理損傷，這也反映了C基因型乙型肝炎病毒感染人體后，病情更容易慢性化且難以治愈，并且病情的發(fā)展較B基因型迅速、難治[12]。

綜上所述，B/C基因型的乙型肝炎病毒在不同免疫階段對(duì)機(jī)體T淋巴細(xì)胞及其亞群的影響是不同的，對(duì)其差異性的對(duì)比分析可以進(jìn)一步幫助了解B/C基因型的乙型肝炎病毒在病情進(jìn)展、預(yù)后、治療等方面的差異。