何思思 邢時云 張大權(quán) 王彥哲 茍小霞（通訊作者）

（1 遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 貴州 遵義 563003）

（2 遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院放療中心 貴州 遵義 563003）

肺腺癌作為非小細(xì)胞肺癌重要類型，致死率高，疾病進(jìn)展迅速，嚴(yán)重威脅人類健康[1-3]。肺腺癌一半以上的患者被診斷為無法治愈的局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病。近年來，免疫治療在肺癌中取得重大進(jìn)展，其中，靶向PD1-PDL1 途徑成為治療非小細(xì)胞肺癌的研究熱點。如今，免疫相關(guān)藥物已被批準(zhǔn)并應(yīng)用于臨床，例如PD-1 抑制劑（nivolumab 和pembrolizumab）和PD-L1 抑制劑（atezolizumab 和durvalumab）[4-6]。但是，只有15%-20%的患者有效。含趨化因子樣因子（CKLF）樣的MARVEL 跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白6（CMTM6）是一種廣泛表達(dá)的蛋白，已被明確鑒定可調(diào)控PD-1 表達(dá)。作為癌細(xì)胞中作為PD-L1 蛋白的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，CMTM6可以與PD-L1 結(jié)合并阻止PD-L1 靶向溶酶體介導(dǎo)的降解，從而增強了對免疫系統(tǒng)的抑制作用并成功逃脫了免疫監(jiān)視。另外，CMTM6 可能參與表觀遺傳調(diào)控，胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生。CMTM6 被報道與免疫相關(guān)，且CMTM 家族蛋白影響臨床預(yù)后[7-10]。上述所有研究都是在細(xì)胞和遺傳水平上進(jìn)行的。肺腺癌中存在EGFR 突變率高，且EGFR 狀態(tài)和患者生存密切相關(guān)。本文旨在初步探究CMTM6 在肺腺癌中表達(dá)情況以及該蛋白表達(dá)與不同EGFR 狀態(tài)是否存在相關(guān)性，以期為進(jìn)一步研究提供參考。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2015 年1 月—2018 年12 月期間的32 例非小細(xì)胞肺癌患者的石蠟肺組織標(biāo)本，均未接受過放化療。32 例患者包括28 例男性患者和4 例女性患者。其中臨床分期為I/II 期占12 例，III/IV 期占20 例。EGFR 突變患者占10 例，EGFR 野生型患者為22 例。實驗試劑：CMTM 6 抗體 (Abcam ab198284)，兔二抗(中杉金橋，PV-9001)，抗原修復(fù)液(檸檬酸三鈉緩沖液)，濕盒，DAB 顯色試劑盒(中杉金橋，ZLI-9018)，蘇木素(上海展云化工 170103)，中性樹膠 (中國上海懿洋41-91)。倒置拍照顯微鏡(OLYMPUS IX71)。

表1 CMTM6 表達(dá)與臨床病理變量之間的關(guān)系（n=32）

1.2 免疫組化方法

脫臘：將組織切片放入二甲苯浸泡20min，反復(fù)2 次。復(fù)水：將切片一次放入到放有100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各3min。抗原修復(fù)：將切片浸入抗原修復(fù)液中，96℃共孵育5min。PBS 漂洗三次。內(nèi)源過氧化物酶滅活：3% H2O2/PBS 室溫孵育10min，PBS 漂洗5min，重復(fù)三次。封閉：5%BSA 封閉液，室溫封閉1h。一抗：加入1% BSA稀釋的一抗CMTM 6 (1：50，兔抗)，4℃過夜孵育。洗片：用1ml 移液槍在切片表面加2ml PBS 洗滌，重復(fù)3 次，每次5min。滴加反應(yīng)增強液：滴加100μl 的反應(yīng)增強液，室溫孵育20min。洗片：用1ml 移液槍在切片表面加2ml PBS洗滌，重復(fù)3次，每5min。滴加增強酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物：滴加100μl 的增強酶標(biāo)山羊抗兔IgG 聚合物，室溫孵育20min，PBS 洗滌重復(fù)3 次，每5min。顯色：在切片的組織部分用200μL移液器加入50μL DAB 顯色液，顯色5min；流水沖洗5min。復(fù)染：滴加1 滴蘇木素至切片的組織上，作用1min，流水沖洗3min。封片：待切片風(fēng)干后，在切片上加1 小滴中性樹膠，蓋上蓋玻片，封片。觀察：進(jìn)行顯微鏡觀察并選取陽性表達(dá)部位拍攝100 倍和200 倍照片。

1.3 病理評分方法

由病理科醫(yī)師讀片證實病理診斷。免疫組化染色結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)師在雙盲情況下獨立檢測，每張切片隨機(jī)取5 個視野求得均值。以“染色強度評分”和“腫瘤細(xì)胞染色陽性率”的乘積為總評分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

通過SPSS 統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用χ2檢驗與相關(guān)分析（逐一將分類變量與CMTM6 表達(dá)行χ2檢驗，P＜0.05 表示兩個分類變量具有相關(guān)性）

2.結(jié)果

如圖1A 中所示，CMTM6 蛋白在肺腺癌患者標(biāo)本中存在顯著差異。32 例肺腺癌組織中，CMTM6 陽性表達(dá)率為59.4%（19/32），占有病例數(shù)一半以上。

圖1A

圖1B

其中病理評分大于9 分占5 例，6 ～9 分占14 例（圖1B）。見表1 中所示，通過SPSS 統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用χ2檢驗與相關(guān)分析（逐一將分類變量與CMTM6 表達(dá)行χ2檢驗，P＜0.05兩個分類變量認(rèn)為具有相關(guān)性），結(jié)果提示CMTM6 的表達(dá)與患者的性別、年齡、是否吸煙、淋巴結(jié)播散情況和臨床TNM 分期無相關(guān)性(P＞0.05)，與EGFR 突變與否無關(guān)(P＞0.05)，與病理分級相關(guān)(P＜0.05)。

3.討論

CMTM6 作為CMTM 家族的成員，作為新的腫瘤調(diào)節(jié)因子，在人體免疫、男性生殖和造血系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要作用。已有研究報道CMTM1 影響非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖并導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。CMTM2 可作為雄性生殖的關(guān)鍵蛋白，先前的研究發(fā)現(xiàn)CMTM2 在涎腺腺樣囊性癌的腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)展中起著重要作用。CMTM3 可以抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。2017 年，CMTM4 和CMTM6 同時被確定為PD-L1 蛋白調(diào)節(jié)劑。據(jù)報道，CMTM6 可以增加PD-L1 蛋白庫而不會影響PD-L1 轉(zhuǎn)錄水平。CMTM6 可以與PD-L1 蛋白締合，減少其泛素化并延長PD-L1 的半衰期。此外，CMTM6 可以維持PD-L1 的表達(dá)，并防止PD-L1 靶向溶酶體介導(dǎo)的降解。通過減少PD-L1，CMTM6 的耗竭顯著減輕了體內(nèi)外腫瘤特異性T 細(xì)胞活性的抑制。

目前，阻斷PD-1/PD-L1 途徑是晚期NSCLC 的標(biāo)準(zhǔn)二線治療?？紤]到CMTM6 在PD-L1 中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，值得研究CMTM6 和CMTM6 在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義。迄今為止，僅在組織病理學(xué)水平上研究了CMTM6 與PD-L1 之間的關(guān)系。此外，最近的一項研究評估了35 例NSCLC 患者的癌組織，結(jié)果表明CMTM6 表達(dá)與P D-L1 表達(dá)呈正相關(guān)（P=0.044）。而腺癌中存在大量EGFR 突變，我們也同時想探究CMTM6 表達(dá)是否與該基因狀態(tài)有關(guān)。

綜上所述，CMTM6 在肺腺癌中表達(dá)存在顯著差異，一半以上的患者樣本CMTM6 有表達(dá)。但CMTM6 與EGFR 突變無明顯相關(guān)性，但這一結(jié)果可能與樣本量有限相關(guān)。本文提示CMTM6 可能與病理分級相關(guān)，這有待于更大樣本的驗證，我們也將從更多樣本及基礎(chǔ)研究中尋找進(jìn)一步結(jié)果。