寧素云，滕 丹，慕楊娜，王 祎，孫笑宇

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西太原 030031；2.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110163；3.遼寧省中醫(yī)研究院，遼寧沈陽(yáng) 110034）

隨著生活水平的日益提高,高血脂癥已經(jīng)逐漸成為我國(guó)最為常見的慢性病之一。高血脂癥狀誘發(fā)的一系列疾病,如糖尿病、高血壓、腦卒中及心梗等的高風(fēng)險(xiǎn)因素［1］。根據(jù)《中國(guó)成人血脂異常防治指南（2016年修訂版）》 數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)血脂異常人數(shù)已達(dá)到4.3億,而且誘發(fā)的冠心病的發(fā)病率以每10年30%的速度遞增［2］。由于高血脂癥屬于代謝類慢性疾病,合理的飲食可以有效防治高血脂癥的發(fā)生,然而,考慮到人群飲食習(xí)慣難于改變,而以藥物對(duì)高血脂癥進(jìn)行糾正常常無(wú)法被患者接受,且存在用藥風(fēng)險(xiǎn)［3］,因此探討藥食同源的藥物改善高血脂癥,是一個(gè)很好的解決方法［4］。

現(xiàn)有的研究顯示,有大量的中藥/有效成分可對(duì)血脂異常進(jìn)行治療。如藥物有紅曲、澤瀉、大黃、虎杖、何首烏、決明子、絞股藍(lán)等,而有效成分則有麥角甾醇、生物黃酮、皂苷、氨基多糖、不飽和脂肪酸等［4］。相比其他中藥飲片,山楂的調(diào)脂功能及應(yīng)用潛力更大。首先,根據(jù)以往的研究,山楂本身含有多種活性成分,如黃酮、有機(jī)酸、膳食纖維和固醇等［5］。其中,山楂黃酮是最重要的降脂有效成分之一［6］。另一方面,山楂是國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)公布的第一批藥食同源中藥材之一。因此,山楂除了可配伍藥物直接組方降脂外,亦可安全地應(yīng)用于食品。然而,現(xiàn)針對(duì)山楂降脂研究多集中于對(duì)其血脂水平的調(diào)節(jié)［7］,或者對(duì)其單一組分的藥理學(xué)研究［8］,而對(duì)藥物整體起效機(jī)制的研究較少?？紤]到山楂有效成分的復(fù)雜性,對(duì)單一成分、單一參進(jìn)行簡(jiǎn)單的研究,已經(jīng)無(wú)法系統(tǒng)了解山楂降低血脂的起效機(jī)制?；诖?本研究擬通過(guò)腸道菌群變化的方式,間接的分析其起效機(jī)制［9］。

越來(lái)越多的證據(jù)表明,腸道微生物對(duì)于高膽固醇血癥的形成有重要作用,甚至腸道菌群失衡是動(dòng)脈粥樣硬化獨(dú)立的危險(xiǎn)因素之一［10］。而微生物群落構(gòu)成,也在脂肪的代謝過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用［11］。大量研究顯示,有效成分可通過(guò)對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié),加速膽固醇的代謝,并進(jìn)一步降低高血脂癥的發(fā)生［12-14］。而以腸道微生物為切入點(diǎn),對(duì)成分復(fù)雜的食物/藥物進(jìn)行機(jī)制研究,是解決復(fù)雜機(jī)制研究的一個(gè)重要的手段?；谏鲜鲅芯勘尘?本研究基于腸道菌群變化對(duì)山楂飼食前后,小鼠腸道微生態(tài)的演替情況進(jìn)行分析,并進(jìn)一步推測(cè)山楂改善高脂模型小鼠的血脂變化的腸道微生物作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究共納入30只28～56日齡的小鼠為研究對(duì)象,除6只為C57BL/6 J小鼠（SCXK蘇202015-0001）外,其余24只均為ApoE -/-小鼠 （SCXK蘇202015-0001）,上述小鼠購(gòu)買自北京隆安實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心［許可證號(hào)SCXK （京）2014-0040］。所有小鼠均按照國(guó)家嚙齒類動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn),飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 材料與儀器 山楂凍干粉（批號(hào)SH-01-02,西安首禾生物科技有限公司,每克凍干粉相當(dāng)于10 g山楂生藥）；E.Z.N.A.? Stool DNA試劑盒 （批號(hào)D4015,美國(guó)Omega Bio-tek公司）；AxyPrep PCR clean up Kit （批號(hào)APPCR-250G,美國(guó)Axygen公司）；Quant-iT Pico Green ds-DNA Assay Kit （批號(hào)P11496,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；MiSeq Reagent Kit V3 （600 cycles）（批號(hào)MS1023003,美國(guó)Illumina公司）；AU5800型全自動(dòng)生化儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。

1.3 分組及建模 6只C57BL/6 J小鼠為正常組,常規(guī)飲食喂養(yǎng)；常規(guī)鼠糧配方為面粉20%、米粉10%、玉米20%、麩皮26%、豆餅20%、魚粉2%以及骨粉2%。其余24只ApoE-/-小鼠均予高脂高膽固醇飲食飼養(yǎng),該飼料是在常規(guī)飼料的基礎(chǔ)上,增加15%動(dòng)物油和0.25%膽固醇。

經(jīng)過(guò)7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后,依據(jù)小鼠體質(zhì)量隨機(jī)為4組（每組6只）。其中,對(duì)照組常規(guī)高脂高膽固醇飲食飼養(yǎng)+生理鹽水灌胃。高、中、低3個(gè)劑量組常規(guī)高脂高膽固醇飲食飼養(yǎng)+山楂凍干粉灌胃,添加劑量分別為1、2、5 g/（kg體質(zhì)量）的山楂凍干粉水溶液。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行12周,小鼠在最后一次灌胃山楂凍干粉水溶液后,禁食24 h,腹腔麻醉后處死小鼠,同時(shí)取小鼠的血樣及大腸內(nèi)容物,做下一步分析。

1.4 血清脂質(zhì)水平 動(dòng)脈取血后,分別應(yīng)用全自動(dòng)生化儀器測(cè)定小鼠血清內(nèi)的TG、TC、LDL-C及HDL-C等參數(shù)的水平。

1.5 腸道微生物測(cè)序及生物信息學(xué)分析 應(yīng)用糞便DNA試劑盒對(duì)研究所收集到的腸道內(nèi)容物樣本進(jìn)行提取,電泳檢測(cè)樣本提取質(zhì)量,并以紫外分光光度計(jì)對(duì)所得的DNA樣本進(jìn)行定量。設(shè)計(jì)16SrDNA保守區(qū)的通用引物,并添加測(cè)序通用接頭和樣本特異性Barcode序列,ACTCCTACGGGAGGCAGCAG （通用引物為338F）,GGACTACHVGGGTWTCTAAT （通用引物為806R）,對(duì)rRNA基因可變區(qū)（V3+V4）或特定基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物通過(guò)2%濃度的瓊脂糖-凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行針對(duì)性的回收,保證插入的片段范圍為200～450 bp。在Promega Quanti Fluor熒光定量的系統(tǒng)內(nèi),應(yīng)用DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物對(duì)比文庫(kù)進(jìn)行定量,確定獲得的PCR濃度為2 nmol/L以上。梯度稀釋合格的上機(jī)測(cè)序文庫(kù),依據(jù)測(cè)序量進(jìn)行混合,NaOH變性后,使所得的PCR變?yōu)閱捂?再進(jìn)一步上機(jī)測(cè)序。測(cè)序以MiSeq進(jìn)行2×300 bp的兩端測(cè)序,應(yīng)用overlap對(duì)獲得的初始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接,質(zhì)控后進(jìn)行嵌入過(guò)濾,最終獲得初始數(shù)據(jù)（rawdata）并再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的可操作分類單元（operational taxonomic units,OTUs）。

應(yīng)用vegan包對(duì)獲得的OTUs在R系統(tǒng)內(nèi)繪制所獲得菌種豐富度指數(shù)（chao1指數(shù)）對(duì)應(yīng)的稀疏曲線；主成分分析（principal components analysis,PCA）則以SMICA 14.1軟件進(jìn)行,首先提取各樣本小鼠糞便樣本內(nèi)對(duì)應(yīng)的OTUs,應(yīng)用excel生成為SMICA 14.1所需的格式,載入軟件后進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化,其中,Model type選擇PCA-x,對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行autofit后,獲得PCA評(píng)分散點(diǎn)圖；為考察各組菌群的具體分布情況,根據(jù)各水平下的OTUs,以TBtools軟件的heatmap包制備熱圖,再根據(jù)各組內(nèi)樣品OTUs的平均值,制備柱狀圖,最終確定各樣本內(nèi)主要菌群在門及屬水平的分布情況；在線進(jìn)行LEfSe分析（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）,分別提取模型-正常、低劑量-模型、中劑量-模型及高劑量-模型等4對(duì)數(shù)據(jù),分別對(duì)其進(jìn)行線性判別分析效應(yīng)量（linear discriminant analysis effect size,LEfSe）分析,對(duì)比各組的線性判別分析 （linear discriminant analysis,LDA）值變化；分別抽取各組的在門水平及屬水平的LDA值,兩兩對(duì)比后,應(yīng)用TBtools的heatmap包,制備熱圖,最終確定模型組內(nèi)重要的差異菌群。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料以（）表示,組間對(duì)比應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山楂粉對(duì)于小鼠血脂的影響 經(jīng)過(guò)12周的自由進(jìn)食后,小鼠的血脂具體變化如表1所示。結(jié)果提示,與空白組比較,模型組小鼠血液內(nèi)的TG、TC、LDL-C含有量顯著升高（P＜0.01）,HDL-C含有量顯著下降（P＜0.01）。給藥組,隨著鼠糧內(nèi)山楂的不斷攝入,小鼠血液內(nèi)的TG、TC、LDL-C含有量也開始下降,HDL-C含有量升高。其調(diào)節(jié)血脂異常的效果,同添加的山楂粉劑量相關(guān)。相比于其山楂低、中劑量組,高劑量組更能顯著降低小鼠內(nèi)的TG、TC及LDL-C水平,同時(shí)提升HDL-C的水平（P＜0.05,P＜0.01）,然而,仍然同正常組有較大的區(qū)別。結(jié)果提示,山楂粉可有效地緩解高脂飲食所致的血脂異常且呈劑量依賴性。

表1 山楂凍干粉對(duì)小鼠血脂水平的影響（， n=6）

表1 山楂凍干粉對(duì)小鼠血脂水平的影響（， n=6）

注：與正常組比較,##P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01。

2.2 山楂粉對(duì)小鼠腸道菌群多樣性變化的影響 為了獲得山楂粉對(duì)小鼠腸道菌群微生態(tài)的影響,本研究考察了5組小鼠的腸道菌群查奧1 （Chao1）值的變化情況,Chao1指數(shù)可反映樣品內(nèi)微生物群落的豐度和多樣性情況,即α 多樣性指數(shù)信息。其具體變化趨勢(shì)如圖1所示。由結(jié)果可知,高劑量組的Chao1指數(shù)顯著性高于其他4組,而低劑量組的Chao1指數(shù)則低于其他各組。上述結(jié)果提示,隨著山楂粉劑量增加,可大幅提升小鼠體內(nèi)的菌群豐富程度。同時(shí),根據(jù)所得結(jié)果可以看出,在整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程中,正常組及模型組內(nèi)豐度的變化,基本無(wú)太大的波動(dòng)?？梢酝茰y(cè),兩組間雖然菌群的構(gòu)成出現(xiàn)差異,但是豐度的變化情況類似,為進(jìn)一步類比上述5組小鼠腸道菌群的變化情況,本研究對(duì)獲得的OTUs信息進(jìn)行了主成分分析。

圖1 不同劑量山楂凍干粉對(duì)小鼠腸道菌群稀釋曲線的影響

2.3 山楂粉對(duì)大鼠腸道菌群主成分差異性分析 PCA分析（主成分差異性分析）可有效地對(duì)獲得的復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降為處理,同時(shí)對(duì)比統(tǒng)計(jì)不同組別內(nèi)數(shù)據(jù)的構(gòu)成相似度。本研究應(yīng)用PCA分析,考察了山楂粉對(duì)小鼠腸道菌群構(gòu)成的影響。由圖2可知,高脂飲食可直接影響小鼠的腸道菌群構(gòu)成,雖然模型組及正常組的Chao1指數(shù)變化接近,但兩組的腸道菌群構(gòu)成有很大區(qū)別。隨著山楂粉的添加,小鼠的腸道菌群構(gòu)成也開始和正常組類似。但是,不同劑量山楂粉亦會(huì)直接影響小鼠的菌群構(gòu)成。如低劑量組和高劑量組的菌群構(gòu)成較為集中,而中劑量組的變化則較大。由PCA的結(jié)果可知,山楂粉的添加可以有效的改善高脂膳食小鼠的菌群構(gòu)成情況。然而,其同正常組相比仍有很大的差異性,特別是中劑量組,雖然其菌群構(gòu)成同模型組有很大區(qū)別,但是同正常組比較,仍然區(qū)別較大?；诖?本研究進(jìn)一步分析不同水平下菌群變化的情況,以確定不同組內(nèi)小鼠的腸道菌群變化情況。

圖2 不同劑量山楂凍干粉對(duì)小鼠腸道菌群構(gòu)成的影響

2.4 山楂粉對(duì)小鼠腸道菌群構(gòu)成的影響 圖3展示了不同組內(nèi)小鼠在門水平上的構(gòu)成情況。由結(jié)果可知,相比于模型組,其他各組內(nèi)擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）的水平顯著性上升。而厚壁菌門（Firmicutes）的變化趨勢(shì)并不明顯。而上述4門為各組內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群。而相比于其他各組,模型組小鼠內(nèi)的無(wú)法分類的細(xì)菌（Bacteria_ unclassified）豐度更高。

圖3 小鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群在門水平上的相對(duì)豐度

圖4 小鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群在屬水平上的相對(duì)豐度

圖4展示了不同組內(nèi)小鼠在菌屬水平上的構(gòu)成情況。由結(jié)果可知,和門水平相比,各個(gè)組內(nèi)菌屬的分布更加分散,而最主要的變化是芽孢桿菌（Bacllaceae_ 2_ unclassified）屬、Parasutterella屬、擬桿菌屬（Bacteroides）屬和Coprpcpccus屬。相比于模型組,其他4組的Bacllaceae_ 2_unclassified的豐度大幅下降,而 Parasutterella屬、Bacteroides屬和Coprpcpccus屬的豐度則大幅上升,結(jié)果提示,上述菌屬是直接影響高脂模型小鼠菌群差異的關(guān)鍵菌屬?？紤]到不同飼喂方式,對(duì)小鼠腸道微生態(tài)的影響較大,為了進(jìn)一步全面對(duì)比各組內(nèi)菌群豐度的變化情況,本研究進(jìn)一步對(duì)菌群進(jìn)行了β 分析,已獲得山楂粉緩解小鼠高脂模型的關(guān)鍵菌門/屬。

2.5 山楂粉調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群構(gòu)成的主要差異菌群 為了獲得山楂粉調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群微生態(tài)的主要差異菌群,本研究應(yīng)用LEfSe分析對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行了β 差異性分析。對(duì)獲得的OTUs的LDA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后,獲得的結(jié)果如圖5所示。由圖5D可知,正常組及模型組的菌群構(gòu)成差異性較大,在各個(gè)水平上（門綱目科屬種）,共有62個(gè)OTUs出現(xiàn)了差異性。另,隨著山楂粉的增加,各組同模型組的差異性也隨之增加,如低劑量組-模型組（圖5A）、中劑量組-模型組（圖5B）及高劑量組-模型組（圖5C）的OTUs差異值分別為35、48、68。該結(jié)果提示,隨著山楂粉劑量的不斷增加,模型組內(nèi)小鼠腸道菌群的構(gòu)成也隨之大幅改變。為了進(jìn)一步的對(duì)比各組變化的菌群及趨勢(shì),本研究分別以各組同模型組OTUs的LDA值制作熱圖,見圖6。

由圖6A可知,在門水平上,正常組-模型組及山楂高劑量組-模型組的差異性相似程度最高,除了Bacteroidetes外,其他各主要構(gòu)成菌門的構(gòu)成基本一致。與之相對(duì),除Deferribacteres （脫鐵桿菌門）外,山楂低劑量組-模型組各主要構(gòu)成菌門的構(gòu)成基本無(wú)差異性。該結(jié)果提示,隨著山楂粉的不斷增加,模型小鼠的腸道菌群構(gòu)成會(huì)隨時(shí)發(fā)生變化,并趨近于正常組小鼠的情況。雖然可以顯著改善模型小鼠的血象（P＜0.05,P＜0.01）,但是其仍然高于正常組（P＜0.05,P＜0.01）。

由圖6B可知,在屬水平上,其結(jié)果同門水平的結(jié)果類似。正常組-模型組及山楂高劑量組-模型組的差異性相似程度最高,而山楂低劑量組-模型組各主要構(gòu)成菌門的構(gòu)成基本無(wú)差異。經(jīng)過(guò)對(duì)屬水平分析后可以看出,腸桿菌（Enterobacier）、支原體（Mycoplasma）在低劑量組及模型組的構(gòu)成無(wú)差異,而在其他3組內(nèi)均顯著上升（| LDA | ＞2.0）。而毛螺旋菌屬 （Parasutterella ）、埃希氏桿菌屬（Escherichia）、毛螺菌屬 （Lachnospiraceae_ unclassified）及艾克曼菌屬（Akkermansia_ unclassified）則僅僅在正常組及高劑量組中濃度顯著性上升（| LDA | ＞2.0）可以將上述菌群,視為山楂粉改善腸道菌群構(gòu)成的生物標(biāo)志物。

3 討論

作為藥食同源的藥物,山楂具有調(diào)節(jié)高血脂癥的功能［7］。然而,此類報(bào)道多以復(fù)方或有效成分角度出發(fā)［15-16］,針對(duì)山楂飲片降血脂的研究并不多見。另一方面,在高瑩等［17］的研究中,山楂和山楂黃酮雖然可以顯著降低大鼠血清的TG水平,但是對(duì)大鼠血清TC沒(méi)有明顯的改善作用,其推論山楂改善血脂的功能同飼料的配方關(guān)系密切。在本實(shí)驗(yàn)中,雖然山楂粉可以改善小鼠的TG、TC、LDL-C及HDL-C等血脂指標(biāo)。然而,即使攝入了山楂粉,小鼠的血脂濃度仍同正常組有很大的區(qū)別（P＜0.05）。另一方面,趙尹銘等［18］報(bào)道山楂的降血脂有效成分有黃酮、熊果酸及山楂膳食纖維等。上述研究提示,山楂改善高血脂癥的機(jī)制極為復(fù)雜,而單純以山楂粉治療小鼠的高血脂癥,將是一個(gè)長(zhǎng)期逐漸改善的過(guò)程。因此,對(duì)其機(jī)制的分析,相比于單純的血脂參數(shù)研究,以腸道菌群構(gòu)成變化的角度為切入點(diǎn),是一個(gè)良好的解決方案。

高脂飲食（high fat diet,HFD）誘發(fā)高血脂癥可致腸道微生態(tài)的變化被廣泛報(bào)道［19-20］。毫無(wú)疑問(wèn),HFD可致血脂積累,并進(jìn)一步誘發(fā)高血脂癥,而在此過(guò)程中,腸道微生態(tài)起到了決定性的作用［21］。在高脂飲食的攝入過(guò)程中,小鼠腸道內(nèi)產(chǎn)生的乙酸菌會(huì)過(guò)度繁殖,并進(jìn)一步提升小鼠腸道代謝物內(nèi)乙酸的濃度,而隨著乙酸濃度的上升,其可刺激β 細(xì)胞分泌了更多的胰島素,并上調(diào)小鼠體內(nèi)胃泌素和胃饑餓素分泌［22］,通過(guò)對(duì)腸-腦軸線（gut-brain axis）的調(diào)整,增加小鼠對(duì)食物的攝入。而HFD可調(diào)整腸道代謝物的組成,最終引起腸道微生態(tài)的改變［23］。考慮到腸道微生態(tài)同脂肪代謝的相關(guān)性,可以推測(cè),山楂在改善血脂癥的過(guò)程中,亦會(huì)直接影響模型小鼠的腸道微生態(tài)變化。

本實(shí)驗(yàn)中,相比于其他4組,高劑量組獲得了最高的Chao1指數(shù)。該結(jié)果表明,大量攝入山楂粉,可以通過(guò)提升HFD小鼠腸道菌群的豐富程度,快速調(diào)整HFD小鼠的腸道微生物構(gòu)成。另一方面,根據(jù)Chao1指數(shù)可以看出,其他4組小鼠的腸道微生物豐富程度接近,結(jié)果提示,在中低劑量下,山楂對(duì)HFD小鼠腸道微生物的調(diào)整較為溫和。為了進(jìn)一步確定各組小鼠腸道微生物的差異性,本研究對(duì)樣本進(jìn)行了PCA分析,相比于模型組,低劑量組及高劑量組都和正常組更為接近。雖然中劑量組的離散情況較為嚴(yán)重,但是參考低劑量組及高劑量組的結(jié)果,可以推測(cè)其是在不斷調(diào)整菌群構(gòu)成的過(guò)程中。由此可知,在山楂緩解HFD小鼠高血脂癥的過(guò)程中,小鼠的腸道微生態(tài)也隨之改變,且HFD小鼠腸道菌群的構(gòu)成情況趨于正常。

根據(jù)對(duì)小鼠腸道微生物構(gòu)成的α 分析結(jié)果可知,相比于模型組,山楂粉組及正常組內(nèi)擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門 （Proteobacteria）、疣微菌門 （Verrucomicrobia）的水平顯著性上升。而厚壁菌門（Firmicutes）的變化趨勢(shì)并不明顯。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,擬桿菌門（Bacteroidetes）同小鼠肥胖發(fā)生的關(guān)系密切,小鼠長(zhǎng)期攝入HFD,腸道內(nèi)的擬桿菌門豐度會(huì)隨之下降［24］。除擬桿菌門外,厚壁菌門的豐度也同HFD相關(guān)。根據(jù)Vaughn等［25］的研究,隨著HFD的攝入,小鼠腸道內(nèi)的厚壁菌門/擬桿菌門（Firmicutes/Bacteriodetes,F/B）比值會(huì)隨之增加。根據(jù)本研究的結(jié)果,隨著山楂粉的攝入,HFD小鼠的腸道微生物F/B值會(huì)隨之下降,提示山楂粉有調(diào)節(jié)F/B值的效果。屬水平上,相比于模型組,其他4組的bacllaceae_ 2_ unclassified的豐度大幅下降,而Parasutterella屬、Bacteroides屬和Coprpcpccus屬的豐度則大幅上升。其中,Parasutterella同血脂膽固醇代謝的關(guān)系密切。在Yin等［26］的研究中,小鼠對(duì)于HFD的響應(yīng)程度很高,而當(dāng)以褪黑素調(diào)節(jié)HFD小鼠脂代謝紊亂時(shí),擬桿菌、Alistipes和Parasutterella的相對(duì)豐度會(huì)隨之增加。根據(jù)Nadal研究可知［27］,bacteroides屬同肥胖患者體質(zhì)量下降反向相關(guān),可以推測(cè),bacteroides屬可加速脂肪的代謝。

圖5 小鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群的LEfSe分析

圖6 小鼠腸道內(nèi)容物腸道菌群的在門及屬水平上的差異值LDA值分布

本研究進(jìn)一步應(yīng)用β 分析對(duì)獲得的結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。根據(jù)LEfSe檢驗(yàn)結(jié)果可知,隨山楂粉飼食劑量的上升,各組小鼠腸道菌群差異性與模型組相比,顯著性提升。結(jié)果提示,隨著山楂粉劑量的增加,小鼠腸道微生態(tài)調(diào)整的也隨之加速。另一方面,本研究又通過(guò)LDA值進(jìn)一步篩選出了山楂改善小鼠高血脂癥的關(guān)鍵微生物,分別為Parasutterella、Escherichia、Lachnospiraceae_ unclassified及Akkermansia_ unclassified。劉思穎等研究［28］在HFD所致脂代謝障礙的小鼠腸道內(nèi),糞球菌屬Akkermansia及Lachnospiraceae較正常組減少,隨著黃芩苷的干預(yù),上述2個(gè)菌屬會(huì)顯著上升；和其研究類似,由于上述兩者僅僅在正常組及山楂高劑量組中劑量顯著性上升| LDA| ＞2.0）,結(jié)果提示,在山楂調(diào)節(jié)脂代謝的過(guò)程中,需要在較高劑量下,長(zhǎng)時(shí)期的飼食,方可實(shí)現(xiàn)對(duì)血脂的控制?？梢源_定,上述菌屬是改善小鼠高血脂癥的過(guò)程中的關(guān)鍵菌屬。

綜上所述,山楂粉可以有效緩解HFD所致的脂代謝紊亂的癥狀,加速腸道菌群的恢復(fù),并通過(guò)對(duì)特定菌群的調(diào)整,實(shí)現(xiàn)其調(diào)節(jié)血脂代謝的目的。然而,本研究?jī)H僅針對(duì)菌群的群落變化進(jìn)行了研究,若要進(jìn)一步的完善其機(jī)制,則需要通過(guò)對(duì)糞便的代謝組學(xué)進(jìn)行交叉對(duì)比后,方可實(shí)現(xiàn)。