金 浩 余 佳王梓瑜 喬 鷗王 軍韓 江李兆連*

（1.云南省第一人民醫(yī)院普通外科，云南昆明 650032；2.昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科，云南昆明 650032；3.武漢大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科，湖北武漢 430060）

肝癌是常見的惡性腫瘤,近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥可以通過抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、以及逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞耐藥性和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面阻止肝癌的進(jìn)展,為肝癌的治療提供了新思路［1-2］。鳳尾草是一種傳統(tǒng)的藥用植物,其有效活性成分包括黃酮類、萜類、苯丙素類、揮發(fā)油等化合物,具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤的作用［3］。研究報(bào)道鳳尾草總黃酮可抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的遷移能力［4］。鳳尾草總黃酮可抑制宮頸癌U14細(xì)胞的生長,其是通過提高機(jī)體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤的作用［5］。鳳尾草提取物在體外對肝癌細(xì)胞株BLE-7402、小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16-BL6、人白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞增殖均有抑制作用［6］。研究表明lncRNA參與腫瘤的轉(zhuǎn)移發(fā)生過程,可作為新型腫瘤標(biāo)志物［7］。磷酸葡萄糖變位酶5反義RNA1（phosphoglucomutase 5 antisense RNA1,PGM5-AS1）是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,研究發(fā)現(xiàn)PGM5-AS1在肺癌中下調(diào)表達(dá),通過抑制細(xì)胞增殖發(fā)揮抑癌功能［8］。PGM5-AS1與黑色素瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)［9］。PGM5-AS1與亞洲人食管鱗癌患者生存相關(guān),可能參與食管鱗癌的形成與進(jìn)展［10］。然而鳳尾草提取物和PGM5-AS1對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響還尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究鳳尾草提取物和PGM5-AS1對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響以及鳳尾草提取物是否通過調(diào)控PGM5-AS1起作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞與試劑 肝癌細(xì)胞株HCC9204 （貨號8691,美國ATCC公司）；胎牛血清（貨號10270-106）、DMEM培養(yǎng)基（貨號11965-175）（上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司）；RIPA蛋白裂解液（貨號BB-3201,上海貝博生物科技公司）；BCA試劑盒（貨號ZKP0746,深圳子科生物科技有限公司）；MTT試劑盒 （貨號8028,美國Sciencell公司）；Transwell小室 （貨號354480）、Matrigel （貨號354234）（美國BD公司）；總RNA提取試劑盒（貨號17200,艾美捷科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號6210 A,北京百奧創(chuàng)新科技有限公司）；熒光定量試劑盒（貨號DRR420 A,北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）。

1.2 藥材 鳳尾草購自亳州市源升堂藥業(yè)有限公司（批號201800329）,經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院浦仕彪教授鑒定為正品。

2 方法

2.1 鳳尾草提取物的制備 將鳳尾草干燥后粉碎,用10倍量70%的乙醇浸泡30 min,回流提取3次,每次1 h,合并3次濾液,去渣后濃縮成浸膏,再用乙酸乙酯反復(fù)超聲提取,得到提取物的濃縮部分,過濾除菌后4 ℃?zhèn)溆?提取率約為21.6%。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 肝癌細(xì)胞株HCC9204用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞HCC9204,分別用0、20、40、80 μg/mL鳳尾草提取物處理記為不同濃度鳳尾草提取物處理組；將pcDNA、pcDNA-PGM5-AS1分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞HCC9204中,分別記為pcDNA組、pcDNAPGM5-AS1組；將si-NC、si-PGM5-AS1分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞HCC9204中再用20 μg/mL鳳尾草提取物處理記為20 μg/mL鳳尾草+si-NC組、20 μg/mL鳳尾草+si-PGM5-AS1組。

2.3 Western blot檢測 Cyclin D1、p21、Ecadherin、MMP2蛋白表達(dá) 收集各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,用BCA試劑盒檢測蛋白濃度,然后將蛋白樣品變性后進(jìn)行電泳,再轉(zhuǎn)至PVDF上,封閉后加入一抗4 ℃孵育過夜,洗膜后加入二抗室溫孵育2 h,然后再用ECL發(fā)光液顯影,成像后檢測蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對表達(dá)。

2.4 MTT檢測細(xì)胞存活率 收集各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞,按照試劑盒說明操作,酶標(biāo)儀檢測490 nm各孔吸光度值（OD）。以實(shí)驗(yàn)組和空白組的OD值比值作為細(xì)胞存活率（%）。

2.5 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell上室和下室分別加入200 μL細(xì)胞懸液和DMEM含血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h后用多聚甲醛固定細(xì)胞,再用結(jié)晶紫染色細(xì)胞,顯微鏡觀察并計(jì)算。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)基稀釋后的Matrigel平鋪Transwell上室,干燥凝固后,同遷移實(shí)驗(yàn)操作。

2.6 RT-PCR檢測PGM5-AS1表達(dá) 收集各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照試劑盒使用說明進(jìn)行PCR,以GAPDH為內(nèi)參,引物序列 PGM5-AS1正向 5′-GGGCGGCTGAAGAAAAGAAGAATG-3′,反 向 5′-TCAACAGACGGCTTCAGTGGTTG-3′；GAPDH正 向 5′-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3′,反向5′-ACGGCCAAATCCGTTCACACC-3′；GAPDH正 向 5′-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3′,反向5′-ACGGCCAAATCCGTTCACACC-3′。反應(yīng)結(jié)束后,相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（）表示,兩組比較行t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度的鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞增殖的影響 與0 μg/mL鳳尾草提取物相比,鳳尾草提取物（20、40、80 μg/mL）處理的HCC9204細(xì)胞中Cyclin D1表達(dá)降低,p21表達(dá)升高,細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）,見圖1、表1。

圖1 不同質(zhì)量濃度鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of P.multifidaextract on proliferating protein expression of HCC9204 cells

表1 不同質(zhì)量濃度鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞增殖的影響（， n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of P.multifidaextract on proliferation of HCC9204 cells （，n=9）

表1 不同質(zhì)量濃度鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞增殖的影響（， n=9）Tab.1 Effects of different concentrations of P.multifidaextract on proliferation of HCC9204 cells （，n=9）

注：與鳳尾草提取物0 μg/mL組比較,*P＜0.05。

3.2 不同濃度的鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與0 μg/mL鳳尾草提取物比較,鳳尾草提取物 （20、40、80 μg/mL）處理的HCC9204細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)升高,MMP-2表達(dá)降低,細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)降低（P＜0.05）,見圖2、表2。

圖2 不同質(zhì)量濃度的鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of P.multifidaextract on migration and invasive protein expression of HCC9204 cells

3.3 鳳尾草提取物對細(xì)胞HCC9204中PGM5-AS1表達(dá)的影響 與0 μg/mL鳳尾草提取物比較,鳳尾草提取物 （20、40、80 μg/mL）處理的HCC9204細(xì)胞中PGM5-AS1表達(dá)升高（P＜0.05）,見表3。

表2 不同質(zhì)量濃度的鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞遷移、侵襲的影響（， n=9）Tab.2 Effects of different concentrations of P.multifidaextract on migration and invasion of HCC9204 cells （， n=9）

表2 不同質(zhì)量濃度的鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞遷移、侵襲的影響（， n=9）Tab.2 Effects of different concentrations of P.multifidaextract on migration and invasion of HCC9204 cells （， n=9）

注：與鳳尾草提取物0 μg/mL組比較,*P＜0.05。

3.4 過表達(dá)PGM5-AS1對HCC920細(xì)胞4增殖、遷移、侵襲的影響 與pcDNA3.1組比較,pcDNA3.1-PGM5-AS1組HCC9204細(xì)胞中PGM5-AS1表達(dá)升高,Cyclin D1、MMP-2表達(dá)降低,p21、Ecadherin表達(dá)升高,細(xì)胞存活率和遷移、侵襲數(shù)量降低（P＜0.05）,見圖3、表4。

3.5 抑制PGM5-AS1能逆轉(zhuǎn)鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞增殖的作用 與20 μg/mL鳳尾草+si-NC組比較,20 μg/mL鳳尾草+si-PGM5-AS1組細(xì)胞HCC9204中PGM5-AS1表達(dá)降低,Cyclin D1表達(dá)升高,p21表達(dá)降低,細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）,見圖4、表5。

表3 鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞中PGM5-AS1表達(dá)的影響（， n=9）Tab.3 Effect of P.multifidaextract on expression of PGM5-AS1 in HCC9204 cells （， n=9）

表3 鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞中PGM5-AS1表達(dá)的影響（， n=9）Tab.3 Effect of P.multifidaextract on expression of PGM5-AS1 in HCC9204 cells （， n=9）

注：與鳳尾草提取物0 μg/mL組比較,*P＜0.05。

3.6 抑制PGM5-AS1能逆轉(zhuǎn)鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞遷移、侵襲的作用 與20 μg/mL鳳尾草+si-NC組相比,20 μg/mL鳳尾草+si-PGM5-AS1組HCC9204細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)降低,MMP-2表達(dá)升高,細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量升高（P＜0.05）,見圖5、表6。

圖3 過表達(dá)PGM5-AS1對HCC9204細(xì)胞增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of PGM5-AS1 overexpression on proliferation，migration and invasive protein expression of HCC9204 cells

表4 過表達(dá)PGM5-AS1對HCC9204細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響（， n=9）Tab.4 Effects of PGM5-AS1 overexpression on proliferation，migration and invasion of HCC9204 cells （， n=9）

表4 過表達(dá)PGM5-AS1對HCC9204細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響（， n=9）Tab.4 Effects of PGM5-AS1 overexpression on proliferation，migration and invasion of HCC9204 cells （， n=9）

注：與pcDNA3.1組比較,*P＜0.05。

圖4 鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的逆轉(zhuǎn)作用Fig.4 Reversed effect of P.multifidaextract on proliferation protein expression of HCC9204 cells

表5 鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞增殖的逆轉(zhuǎn)作用（， n=9）Tab.5 Reversed effect of P.multifidaextract on proliferation of HCC9204 cells （， n=9）

表5 鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞增殖的逆轉(zhuǎn)作用（， n=9）Tab.5 Reversed effect of P.multifidaextract on proliferation of HCC9204 cells （， n=9）

注：與鳳尾草20 μg/mL+si-NC組比較,*P＜0.05。

4 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展受多因素調(diào)節(jié),研究發(fā)現(xiàn)中藥聯(lián)合用藥治療惡性腫瘤具有多靶點(diǎn)、療效持久、毒副作用低等優(yōu)勢,已成為抗腫瘤藥物重要的研究方向［11］。有研究報(bào)道鳳尾草總黃酮可抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的遷移能力［12］。鳳尾蕨總黃酮能抑制H22荷瘤小鼠腫瘤生長［13］。鳳尾草甲醇提取物對宮頸癌細(xì)胞HeLa、肺癌細(xì)胞NCI-H460和乳腺癌細(xì)胞MCF-7均具有抗癌活性［14］。從鳳尾草根分離出的蝶呤化合物具有抗人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116增殖的活性［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度鳳尾草提取物處理的肝癌細(xì)胞HCC9204中Cyclin D1、MMP-2表達(dá)水平顯著降低,p21、E-cadherin表達(dá)水平顯著升高,HCC9204細(xì)胞存活率顯著降低,HCC9204細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低。說明鳳尾草提取物可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

圖5 鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達(dá)的逆轉(zhuǎn)作用Fig.5 Reverse effects of P.multifidaextract on migration and invasive protein expression of HCC9204 cells

PGM5-AS1是間變性膠質(zhì)瘤患者中免疫相關(guān)的lncRNA［16］。研究發(fā)現(xiàn)PGM5-AS1在乳腺癌中低表達(dá)［17］。 PGM5-AS1在食道鱗狀細(xì)胞癌組織,血漿和細(xì)胞系中也下調(diào)表達(dá),其低表達(dá)與患者不良分化,晚期腫瘤結(jié)轉(zhuǎn)移（tumor node metastasis,TNM）分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；p53誘導(dǎo)PGM5-AS1可在體外抑制食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲［18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)PGM5-AS1可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。表明PGM5-AS1在肝癌中同樣起抑癌基因作用。且本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)不同濃度鳳尾草提取物處理的肝癌細(xì)胞HCC9204中PGM5-AS1表達(dá)水平顯著升高,抑制PGM5-AS1逆轉(zhuǎn)了鳳尾草提取物對細(xì)胞HCC9204增殖、遷移和侵襲的抑制作用。提示,鳳尾草提取物可能通過上調(diào)PGM5-AS1抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

表6 鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞遷移、侵襲的逆轉(zhuǎn)作用（， n=9）Tab.6 Reversed effects of P.multifidaextract on migration and invasion of HCC9204 cells （， n=9）

表6 鳳尾草提取物對HCC9204細(xì)胞遷移、侵襲的逆轉(zhuǎn)作用（， n=9）Tab.6 Reversed effects of P.multifidaextract on migration and invasion of HCC9204 cells （， n=9）

注：與鳳尾草20 μg/mL+si-NC組比較,*P＜0.05。

綜上所述,鳳尾草提取物可能通過上調(diào)PGM5-AS1抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。