李赤霞，陳 瀅，張 萌，陳玉娟，田元元，王友升,3,

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學輕工科學技術學院，北京 100048；

2.山東凱普菲特生物科技有限公司，山東 日照 276800；3.日照華偉大健康產業(yè)研究院，山東 日照 276800）

白假絲酵母（Candida albicans）屬于食源性致病酵母菌[1]，近年來在國內外食品中常檢出C. albicans，其中乳制品是易被其污染的第一大類產品[2]。C. albicans在正常情況下呈卵圓形，不引起疾病，而當機體免疫力低下或菌群失調時，會改變生長形式，出芽生成假菌絲并感染機體細胞，最終導致生理性疾病的發(fā)生[3]。C. albicans作為食品中的條件致病菌，其致死率可達40%[4]，所以對其毒性和菌絲生長的研究極為重要。環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）作為生物體內第二信使調控著重要的生理代謝反應，而磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）是降解環(huán)核苷酸的一類酶[5]。在哺乳動物細胞中存在約30 種PDE，但是在真菌生物中，目前僅有兩類PDE被發(fā)現，其中PDE1屬于II類PDE超家族成員，而PDE2屬于I類PDE超家族成員，其對cAMP具有較高的親和力[6-8]，且PDE2與人類PDEs蛋白具有相似的折疊結構[9]。研究表明，cAMP信號通路在酵母的細胞壁合成、細胞生長等生長代謝活動以及致病毒性中起到重要作用[10-16]；同時，Wilson等[14]對C. albicansPDE的研究表明，pde2基因的缺失會導致菌絲發(fā)育不完全和細胞壁不完整，從而對其毒性產生影響；有學者證明部分抑菌劑對C. albicans抑菌作用的主要機制是抑制PDE2蛋白的表達[17-19]。所以目前對C. albicansPDE2蛋白的研究已成為其假菌絲生長和毒性調控的重要研究方向。

本研究將大腸桿菌作為表達載體，通過異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導目的蛋白異源表達，利用3 種層析方法進行純化，獲得高純度C. albicansPDE2蛋白，并通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析PDE2蛋白酶的特性。旨在為該蛋白的晶體學分析及C. albicans的生理病理機制研究提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌體與質粒

野生型C. albicans，大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10、BL21，質粒pET28a和pGEM-T，均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑

NheI、EcoRI內切酶 美國Biolab公司；DNA回收試劑盒、高純質粒小提試劑盒、DNA分子質量標準Marker 美國Thermo公司；cAMP、cGMP、卡那霉素、Tris-base 美國Amresco公司；乙二胺四乙酸鈉中國北京西隴化工有限公司；氯仿 國藥集團化學試劑有限公司；X-gal 美國Sigma公司；IPTG 美國Thermo Fisher Scientific公司；酵母浸粉、胰蛋白胨 北京奧博星生物技術有限公司；氯化鈉 北京化工廠；瓊脂中國Biotopped公司。

Ni-NTA agarose 德國Qiagen公司；Q-SepharoseTMFast Flow、SephacrylTMS200 High Resolution 美國GE Healthcare公司。

1.2 儀器與設備

French PressSL-650D超聲破碎儀 南京順流儀器公司；層析實驗冷柜 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；PHS-3D pH計 上海儀表有限公司；Forma Class II凈化工作臺美國Thermo公司；5810R臺式冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；2695 HPLC儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取

C. albicans在酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基中28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)過夜，A600nm達到2.0～3.0后離心集菌，并參照王繼英等[20]的酚-氯仿法提取C. albicans的基因組DNA。

1.3.2 重組質粒載體的構建

根據C. albicanspde2基因序列（NCBI Gene ID：3636877）設計引物，該基因CDS序列全長為1 716 bp[21]。上游引物序列為：5’-CGGCTAGCATGTCATTTGAAA TCACAAT-3’（下劃線為NheI酶切位點）；下游引物序列為：5’-CGGAATTCTACTATAATTGAGGTGCCAC-3’（下劃線為EcoRI酶切位點）。引物擴增目的基因片段連接至pGM-T載體，采用熱激法轉化至大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)16 h進行菌落PCR擴增，鑒定插入片段。將已鑒定目的基因片段連接到pET28a載體上，最終獲得pET28a-C. albicanspde2重組質粒，重組質粒通過NheI和EcoRI雙酶切鑒定[22]。

1.3.3 pET28a-C. albicanspde2重組質粒誘導表達

將pET28a-C. albicans pde2重組質粒轉入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，經37 ℃過夜培養(yǎng)后，接種至含0.4%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中。0.1 mmol/L IPTG 12 ℃低溫誘導48 h后，10 000 r/min離心5 min收集菌體。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析誘導0、24、48 h菌體中目的蛋白的表達含量。

1.3.4C. albicansPDE2蛋白分離純化

1.3.4.1 菌體破碎

按照1∶10的比例加入提取液并重新懸浮收集的表達菌體，超聲破碎（工作5 s，間歇8 s）菌體30 min，10 000 r/min離心30 min后，分別對破碎總蛋白、上清液蛋白以及沉淀蛋白進行SDS-PAGE檢測[23]。

1.3.4.2 基于重組蛋白多重性質的分離純化

參照Zhang Wei等[24]的方法進行Ni-NAT柱分離純化，將超聲破碎上清液蛋白加入至Ni-NAT柱吸附并洗脫收集目的蛋白。Ni-NAT純化后的C. albicansPDE2蛋白透析置換24 h后，加入牛凝血酶于室溫酶切3 h。酶切后的蛋白加入Q-Sepharose柱進行分離純化后，超濾濃縮至10 mL左右。濃縮蛋白進行Sephacryl S200分子篩純化[25]。Ni-NAT柱、Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱分離純化過程中測定蛋白收集液的A280nm，A280nm等于1被定義為蛋白濃度為1 U，收集蛋白進行SDS-PAGE和非變性凝膠電泳檢測分析。最終蛋白濃縮至10 mg/mL并冷凍保存。

1.3.5C. albicansPDE2蛋白酶活力測定

分離純化的C. albicansPDE2蛋白應用HPLC進行酶學特性測定，參照Hou Jing等[26]方法。反應體系采用單一底物和雙底物兩種方式檢測重組蛋白的酶活特性，反應溫度25 ℃，反應時間30 min。根據cAMP和cGMP的峰面積，計算反應底物的水解率。

色譜條件：色譜柱：Intertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相A為0.02 mol/L KH2PO4溶液，流動相B為甲醇，洗脫條件為82% A、18% B。檢測波長252、258 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1 C. albicans pde2基因克隆

運用酚-氯仿法提取C. albicans基因組DNA，結果見圖1a，在10 000 bp以上有明顯條帶，證明成功獲得了C. albicans基因組DNA。利用C. albicans pde2基因引物，通過PCR擴增目的基因片段，DNA凝膠電泳如圖1b所示，在1 500～2 000 bp之間有明顯的條帶，大小與C. albicans pde2基因的大?。? 716 bp）一致，證明目的基因片段可以被正確擴增。

圖1 C. albicans基因組DNA（a）及目的基因PCR擴增產物（b）凝膠電泳Fig. 1 Agarose gel electrophoresis patterns of C. albicans genomic DNA (a) and PCR amplified product of target gene (b)

2.2 重組質粒載體構建

將擴增所得C. albicans pde2目的片段與pGM-T載體相連，雙酶切驗證電泳結果見圖2a，3 000 bp處條帶為載體pGM-T條帶，1 700 bp處條帶為目的基因條帶，證明成功獲得pGM-T-C. albicans pde2質粒。將酶切后膠回收產物與pET28a載體酶切產物連接，獲得重組pET28a-C. albicans pde2質粒。對所構建的重組質粒進行雙酶切驗證，由圖2b可知，酶切后在6 000 bp和1 700 bp左右有明顯條帶，其中6 000 bp處為pET28a質粒載體條帶，1 700 bp左右的條帶為目的基因條帶，證明重組pET28a-C. albicans pde2質粒構建成功。

圖2 C. albicans pde2目的基因PCR擴增產物與質粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳Fig. 2 Agarose gel electrophoresis patterns of C. albicans pde2 and plasmid subjected to double enzymatic digestion

2.3 pET28a-C. albicans pde2重組質粒誘導表達

IPTG低溫誘導48 h后收集菌體5 g/L，分別取樣誘導24 h和48 h的菌體，SDS-PAGE見圖3。誘導24 h，蛋白表達量較少，幾乎沒有目的蛋白條帶。誘導48 h后，60 kDa處蛋白含量顯著增加，該條帶與預期目的蛋白（約62 kDa）條帶一致，表明該誘導條件能夠在IPTG誘導48 h后獲得大量的目的蛋白，最終獲得菌體4.5 g/L。

圖3 C. albicans PDE2蛋白不同誘導時間表達水平SDS-PAG分析Fig. 3 SDS-PAGE results of C. albicans PDE2 protein samples expressed at different times

2.4 C. albicans PDE2蛋白的分離純化

將C. albicansPDE2表達菌體超聲破碎后取樣進行SDS-PAGE，結果如圖4a所示，離心上清液中目的蛋白含量極高，證明該誘導條件下目的蛋白水溶性較強，形成極少量的包涵體。將離心上清液蛋白加入Ni-NAT親和層析柱中進行分離純化，最終獲得70 U蛋白。對蛋白含量大于1 U收集管取樣進行SDS-PAGE，結果見圖4b，目的蛋白條帶占比高，說明重組目的蛋白與Ni-NAT柱親和能力強，且經過蛋白純度明顯升高。證明Ni-NAT柱能夠對目的重組蛋白進行有效的分離純化。

圖4 C. albicans PD2蛋白超聲破碎及Ni-NAT純化SDS-PAG結果Fig. 4 SDS gel electrophoresis profiles of crude PDE2 protein from ultrasonically disrupted C. albicans cells and Ni-NAT purified protein

Ni-NAT柱分離純化后的蛋白，進行24 h的透析置換。牛凝血酶切除目的蛋白的His-tag標簽，使目的蛋白更好地與Q-Sepharose柱結合，結果見圖5a，經過3 h的室溫酶切，蛋白分子質量有明顯降低，證明該酶切條件適合重組目的蛋白。酶切后的蛋白質經過Q-Sepharose柱分離純化，共收集目的蛋白55 U，結果如圖5b所示，電泳結果幾乎沒有雜蛋白條帶，說明雜蛋白的含量明顯降低，因此證明Q-Sepharose柱可以使目標蛋白得到進一步分離純化。

圖5 C. albicans PD2蛋白酶切（a）及Q-Sepharose柱純化（b）SDS-PAG結果Fig. 5 SDS gel electrophoresis profiles of enzymatically cleaved C. albicans PDE2 (a) and Q-Sepharose purified protein (b)

將Q-Sepharose柱純化的蛋白濃縮并加入Sephacryl S200柱，通過分子篩分離純化，SDS-PAGE檢測結果如圖6a所示，Sephacryl S200柱純化后，目的蛋白純度得到進一步提高。利用非變性凝膠電泳檢測濃縮后純化蛋白的活性，如圖6b所示，結果表明經過多步純化后，目的蛋白條帶清晰可見且沒有雜蛋白條帶，說明Ni-NAT柱、Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱分離純化過程中C. albicansPDE2蛋白沒有發(fā)生凝聚，能夠維持其生理結構和生物學活性，且蛋白純度得到極大提高。

圖6 C. albicans PD2 Sephacryl S200柱純化SDS-PAG（a）及非變性凝膠電泳（b）結果Fig. 6 Purification of C. albicans PDE2 on Sephacryl S200 column (a)and non-denaturing gel electrophoresis results (b)

表1 C. albicans PD2蛋白純化回收率Table 1 Recovery of purified C. albicans PD2 protein

表1 C. albicans PD2蛋白純化回收率Table 1 Recovery of purified C. albicans PD2 protein

菌體質量/g Ni-NTA Q-Sepharose Sephacryl S200 平均蛋白收集量/（U/g）蛋白回收率/%10 70 100 55 78.57 28 40 2.8蛋白收集量/U蛋白回收率/%蛋白收集量/U蛋白回收率/%蛋白收集量/U

以Ni-NTA柱純化得到的蛋白含量為100%，計算Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱純化過程中蛋白的回收率。如表1所示，C. albicansPDE2蛋白在每步純化過程中，損耗約30%蛋白，這可能是由于蛋白純度的增高導致，同時在經歷柱層析時，目的蛋白也存在著一定量的流失。最終平均每克表達菌體可獲得2.8 U目的蛋白。

2.5 C. albicans PDE2蛋白酶活性分析

應用HPLC法測定所獲得的目的蛋白酶活力，測定不同濃度蛋白對cAMP和cGMP的水解率，且將底物設置為0.4 mmol/L的單底物與雙底物兩種體系，通過其對兩種體系的水解情況，確定其對于cAMP和cGMP的親和作用，結果如表2所示。在單底物的情況下，相同質量濃度的C. albicansPDE2對cGMP的水解能力略低于cAMP，說明C. albicansPDE2對cAMP具有更高的親和力。在雙底物的體系中，0.385 mg/mL質量濃度下，0.05 mmol/L和0.1 mmol/L濃度的cAMP能夠被完全水解，但0.05 mmol/L濃度的cGMP水解率僅達到了53.53%，說明雙底物體系中C. albicansPDE2優(yōu)先水解cAMP。因此，兩種體系均證明了C. albicansPDE2對cAMP具有更高的親和力。

表2 不同質量濃度C. albicans PD2對底物的水解率Table 2 ydrolysis efficiency of substrates by different concentrations of C. albicansPD2

表2 不同質量濃度C. albicans PD2對底物的水解率Table 2 ydrolysis efficiency of substrates by different concentrations of C. albicansPD2

%酶質量濃度/（mg/mL） 底物 cAMP/cGMP（0.4 mmol/L）0.05 mmol/L cAMP＋0.35 mmol/L cGMP 0.1 mmol/L cAMP＋0.3 mmol/L cGMP 0.2 mmol/L cAMP＋0.2 mmol/L cGMP 0.35 mmol/L cAMP＋0.05 mmol/L cGMP 0.385 cAMP 77.11±13.35 100.23±0.01 100.12±0.01 99.55±0.72 87.17±1.91 cGMP 61.15±24.09 64.12±6.77 63.66±9.53 55.96±27.48 53.53±1.58 0.077 cAMP 28.42±1.63 100.23±0.01 62.67±4.39 42.71±2.91 52.31±24.88 cGMP 20.81±0.19 16.39±2.09 15.92±3.3 19.51±0.82 27.05±16.62 0.015 3 cAMP 8.88±1.34 21.34±9.54 20.27±5.64 12.8±0.74 10.56±3.1 cGMP 7.48±0.13 5.9±2.67 8.62±0.62 9.56±1.13 7.62±0.4

3 結 論

目前，廣大研究學者對真菌的調控進行了廣泛研究，其中環(huán)核苷酸磷酸酶PDE能夠對真菌起到重要的調控作用。如Zhang Haifeng等[27]對稻瘟病菌的毒性作用機制的研究中，發(fā)現兩種pdeL/pdeH基因對菌絲生長、孢子生成等起到重要調控作用；有研究通過過量表達酵母菌的pde2基因，使酵母具有較高的乙醇耐受性[28-29]。因此以上結論充分證明了真菌胞內PDE2對于菌體的生長代謝及致病性有著重要的調控作用。本研究通過IPTG誘導大量表達蛋白菌體，通過多種柱層析手段對目的蛋白進行分離純化，最終得到高純度的C. albicansPDE2蛋白，平均每克表達菌體可獲得2.8 U蛋白。通過HPLC檢測底物減少量或產物生成量分析蛋白酶的水解能力，從而確定所獲得的酶活力。結果表明所純化的蛋白具有較高的水解cAMP和cGMP的能力，其在0.385 mg/mL質量濃度下，對0.4 mmol/L的cAMP和cGMP的水解率達到60%～70%，這與前期報道釀酒酵母PDE1作用方式一致[30]。但是該酶對cAMP的親和力高于cGMP。本研究得到高純度、高活性的C. albicansPDE2，為蛋白的晶體學解析提供前期基礎，以期進一步篩選以該酶為靶點的天然活性物質，以及解析食品中C. albicans的生長和致病性調控機制。