拜小強(qiáng)，耿金靜，白生菊，魏鎖成*，李瓊毅

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030)

輪狀病毒（Bovine rotavirus，BRV）是引起哺乳期犢牛群發(fā)病毒性腹瀉的主要病原之一，約占犢牛腹瀉病例的46%[1]。7日齡內(nèi)的新生犢牛因消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，而易發(fā)感染且病癥嚴(yán)重，以食欲廢絕、消化道機(jī)能紊亂及水樣糞便為典型臨床癥狀[2]。該病毒具有株型眾多、易發(fā)重排、宿主廣泛、傳播迅速等生物學(xué)特性，加之該病致死率最高達(dá)50%，尚無高效疫苗和特效藥物，使得牛養(yǎng)殖業(yè)遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。另外，已證實(shí)RV可在人畜間交叉?zhèn)鞑?，也?duì)人類公共衛(wèi)生安全存在潛在威脅[4-7]。

BRV為雙鏈RNA病毒，屬呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬成員，病毒粒子呈直徑60～80 nm的二十面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，其雙鏈RNA基因組由11個(gè)不連續(xù)的基因片段組成，共編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～4、VP6、VP7）和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1～6）[8]。其中第4片段編碼的VP4黏附蛋白，由776個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約為88 kDa，現(xiàn)已被證實(shí)與BRV的毒力、血凝作用及抗原特性存在密切聯(lián)系[9]。有研究表明，輪狀病毒入侵宿主細(xì)胞過程中，VP4蛋白被胰蛋白酶水解為VP5和VP8兩個(gè)多肽[10]。VP5(60 kDa)與病毒吸附及侵入功能相關(guān)，進(jìn)而破壞細(xì)胞抑制機(jī)制，而VP8（28 kDa）含血凝素抗原和中和抗原，聚集著VP4的主要抗原位點(diǎn)，在疫苗研發(fā)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。因此，經(jīng)胰酶消化激活的VP4結(jié)構(gòu)蛋白使得BRV的致病性大大增強(qiáng)[12]。輪狀病毒株型眾多，根據(jù)VP4抗原特性，將BRV分為不同的P型（P-serotype）[13]，基于VP4的分型功能和抗原特性，該基因片段可用作BRV的檢測(cè)靶點(diǎn)，為建立特異的病原檢測(cè)方法提供了理論支持。目前，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)BRV的方法主要有經(jīng)典病原檢測(cè)（電鏡和病毒分離）、免疫學(xué)檢測(cè)（ELISA）和基因檢測(cè)（PCR）三類，熒光定量PCR能快速鑒別診斷病原，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可實(shí)時(shí)定量監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)，被用于目的基因測(cè)試、基因表達(dá)分析、病原體檢測(cè)中[14]。本研究以BRV VP4基因作為檢測(cè)靶基因設(shè)計(jì)引物，建立了EvaGreen熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，為牛輪狀病毒的快速檢測(cè)診斷提供一種經(jīng)濟(jì)高效的檢測(cè)手段。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞及病料

牛輪狀病毒NCDV株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心（保存編號(hào)：AV51），MA-104細(xì)胞接毒培養(yǎng)物-80℃保存；感受態(tài)細(xì)胞BL-21、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛冠狀病毒（Bovine coronavirus，BCV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和牛結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium bovis，MB）保存于西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；1月齡以下犢牛腹瀉（持續(xù)腹瀉3 d以上）糞便樣品共47份采集自甘肅蘭州市、張掖市和甘南州。

1.2 主要試劑

主要試劑和來源見表1。

1.3 病料樣本處理

將采集的犢牛腹瀉糞便樣品與PBS按1∶10混合，渦旋振蕩混勻后25℃、3 000 rpm離心20 min，吸取上清液，按輪狀病毒診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)說明書步驟進(jìn)行定性檢測(cè)，測(cè)得的陽性樣品保存于-80℃冰箱中。

1.4 引物設(shè)計(jì)

參考Genbank（Accession：JF693029）發(fā)表的BRV VP4核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物（BRV-VP4-F/BRV-VP4-R），經(jīng)NCBI Primer-BLAST分析驗(yàn)（見表2），完成設(shè)計(jì)的引物交由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

取BRV毒液和ELISA檢測(cè)陽性樣本，用病毒RNA提取試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA作為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶連接至pMD 18-T克隆載體，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定的陽性重組質(zhì)粒保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 主要試劑和來源

表2 引物序列信息

1.6 優(yōu)化反應(yīng)條件

RT-qPCR反應(yīng)體系：EvaGreen RT-qPCR Master Mix 25 μl；上下游引物（BRV-VP4-F/R）各1 μl；待測(cè)cDNA模板5 μl；DEPC水18 μl；總體積50 μl。對(duì)設(shè)定的變性、退火、延伸反應(yīng)條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。pMD 18-T-VP4質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10-1～103共5個(gè)梯度稀釋（copies/μl）后重復(fù)3次EvaGreen熒光定量檢測(cè)，建立橫軸為模板起始拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值，縱軸為Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 敏感性檢測(cè)

對(duì)構(gòu)建的pMD 18-T-VP4質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 10-1、100、101、102和103梯度稀釋，用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，對(duì)比分析得出最低檢測(cè)限度。

1.8 特異性試驗(yàn)

用建立的EvaGreen熒光定量檢測(cè)方法對(duì)BRV、BVDV、BCV、CSFV、PEDV和MB進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品做3次重復(fù)試驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置空白和陰性對(duì)照。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)pMD 18-T-VP4質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作5個(gè)倍比稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，記錄Ct值，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出VP4基因含量（copies/μl）。組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：將5個(gè)梯度稀釋的陽性質(zhì)粒進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算拷貝數(shù)，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)量3次，求組內(nèi)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。組間重復(fù)試驗(yàn)：不同質(zhì)粒含量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行RT-qPCR 3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，求組間平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 BRV VP4基因的擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用VP4基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，結(jié)果表明擴(kuò)增的條帶約為890 bp，與測(cè)序結(jié)果一致（見圖1）。

圖1 VP4基因擴(kuò)增條帶

2.2 RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)建立的RT-qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。以優(yōu)化后的RT-qPCR檢測(cè)5個(gè)不同濃度（10-1～103）的重組質(zhì)粒pMD 18-T-VP4，其Ct值分別為29.02、25.35、20.78、17.86和14.73。得出標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.425，截距為30.86，相關(guān)系數(shù) R2=0.992，Ct值之間呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為Y=-3.425X+30.86；X為陽性質(zhì)粒模板拷貝數(shù)以10為底的對(duì)數(shù)值。從而可以得出X與Ct值之間的線性關(guān)系曲線方程式為Ct=30.86-3.425X。不同濃度重組質(zhì)粒的Ct值，從試驗(yàn)結(jié)果中直接讀取，Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可計(jì)算出VP4初始拷貝數(shù)。

表3 RT-qPCR檢測(cè)BRV VP4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

5個(gè)梯度稀釋（10-1～103）的pMD 18-T-VP4質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值分別為29.02、25.35、20.78、17.86和14.73，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出的拷貝數(shù)分別為1.72×103、3.25×102、5.76×101、7.21×100和9.36×10-1，表明該方法的最低檢出量為7.21 copies/μl。

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果

用建立的RT-qPCR檢測(cè)BRV、BVDV、BCV、CSFV、PEDV和MB。試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅BRV出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他病毒和細(xì)菌無任何擴(kuò)增，陰性對(duì)照亦無擴(kuò)增，即只對(duì)BRV的cDNA有良好的擴(kuò)增，表明建立的方法有良好的特異性（見圖3）。

圖3 BRV RT-qPCR特異性檢測(cè)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)5個(gè)稀釋度的pMD 18-T-VP4重復(fù)檢測(cè)，組內(nèi)CV為0.95 %～1.12 %；組間CV為1.55 %～2.18%（見表3），表明RT-qPCR方法穩(wěn)定可靠。

2.6 臨床樣本檢測(cè)

應(yīng)用本研究建立的RT-qPCR檢測(cè)方法檢測(cè)21份ELISA陽性糞樣，結(jié)果顯示：19份呈陽性，2份為陰性，與ELISA檢測(cè)的陽性符合率為90.47 %。

3 討論

輪狀病毒在人與動(dòng)物、不同動(dòng)物之間有一定的交叉感染，嬰幼兒和低齡動(dòng)物容易通過糞-口途徑感染RV，造成小腸絨毛縮短，絨毛上皮細(xì)胞凋亡，機(jī)能減退為病癥的急性胃腸道傳染病[14,15]。在牛群中感染A組輪狀病毒最為常見[16]，1980年福建畜牧獸醫(yī)研究所首次在我國發(fā)現(xiàn)BRV的存在[17]，隨后在各地牛群中陸續(xù)分離出不同株型的BRV[18-20]，以G10和G6株型最為普遍[21]。VP4基因編碼衣殼黏附蛋白，通常根據(jù)VP4確定BRV的基因型。盡管VP4蛋白在病毒蛋白總量的約為1.5 %[22]，但同基因型毒株比對(duì)，VP4的核苷酸序列和氨基酸序列高度保守，同源性可達(dá)94.6 %～97.8 %[23]，在保證病毒毒力的情況下，可以將該基因作為靶基因進(jìn)行BRV病原檢測(cè)。持續(xù)感染（PI）動(dòng)物是主要的傳染源，成年牛只隱性感染BRV且持續(xù)排毒，能高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)隱性持續(xù)感染動(dòng)物成為阻斷BRV傳播、凈化牛養(yǎng)殖場(chǎng)的關(guān)鍵一步。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)熒光信號(hào)的變化對(duì)PCR過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，在畜禽傳染病原檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用[24-26]。目前以VP4基因作為靶點(diǎn)建立的BRV熒光定量PCR報(bào)道較少，本試驗(yàn)應(yīng)用相對(duì)保守的VP4基因作為檢測(cè)靶點(diǎn)，擴(kuò)增目的片段后連接載體，重組獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立的RT-qPCR最低檢測(cè)量為7.21 copies/μl；同步檢測(cè)5種病毒/菌均無擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照亦無擴(kuò)增；組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)變異系數(shù)分別為0.95%～1.12 %和1.55%～2.18%；應(yīng)用該方法檢測(cè)21份ELISA陽性樣本，檢測(cè)符合率為90.47 %。經(jīng)臨床樣品檢測(cè)，證實(shí)本方法可行，為牛輪狀病毒的初步篩查診斷提供了一種可參考的檢測(cè)手段。