李越洲，張 勇

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

高等脊椎動物均存在主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex, MHC）[1,2]的表達(dá)，其表達(dá)高低對動物的免疫排斥反應(yīng)有一定的影響，且與動物抗病性關(guān)聯(lián)[3]。MHC作為動物疾病抗性和易感性基因，其相關(guān)的研究對輔助選擇動物抗病育種具有重要意義[4,5]。豬MHC又稱為SLA（Swine Lymphocyte Antigen），位于7號染色體上，分為三個主要類群[6]。SLA基因的多態(tài)性與動物免疫反應(yīng)高度關(guān)聯(lián)，其中第二類群（SLAⅡ）基因的表達(dá)參與調(diào)控了外源性病原和相關(guān)疫苗制劑的免疫應(yīng)答過程[7]。目前SLAⅡ中4個重要功能基因DRA、DRB、DQA和DQB研究最為廣泛。研究表明這些基因在控制機(jī)體的免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用[8]，且參與調(diào)控豬的抗病性能[7,8]。

合作豬又叫蕨麻豬、山豬或草豬，是甘肅省甘南藏族自治州特有的高原小型原始地方品種，其抗逆性（抗病、抗寒和抗高原等）的研究可為地方豬抗病選育提供重要參考。利用單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分析個體基因組可更好地解釋個體的表型差異[6]。目前有關(guān)豬SLA 基因功能研究主要在SLAⅡ 的DRA和DQA基因及DRB 外顯子2。合作豬SLA 基因功能的研究報(bào)道甚少。解析合作豬SLA基因與個體表型差異和遺傳相關(guān)性，可為引進(jìn)地方優(yōu)質(zhì)品種和高經(jīng)濟(jì)價(jià)值國外豬品種提供依據(jù)。研究其多態(tài)性位點(diǎn)及遺傳關(guān)聯(lián)性對豬品種保護(hù)以及分子遺傳選育具有重要價(jià)值。

該研究選用PCR-SSCP和DNA克隆及測序等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)對合作豬DRB基因的第3外顯子序列多態(tài)性分析，為深入揭示合作豬的免疫、抗病力的分子理論提供支持，同時(shí)為地方優(yōu)質(zhì)豬品種遺傳育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以合作豬為實(shí)驗(yàn)動物。采集甘肅省甘南藏族自治州合作市的合作豬血樣286份，每份5 ml抗凝血，-20℃凍存?zhèn)溆?。采用苯?氯仿抽提法[9,10]提取其基因組DNA，TE溶解，-20℃凍存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank數(shù)據(jù)庫合作豬SLADRB基因全序列（登錄號：FJ905840.1）設(shè)計(jì)一對引物（見表1），引物由北京華大生物公司合成，其擴(kuò)增片段為332 bp。

表1 合作豬DRB基因的外顯子3引物相關(guān)信息

1.2.2 PCR擴(kuò)增 以DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得DRB外顯子3序列。具體PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程如下[11]：總體積為 20 μl，其中包含 200 ng/μl 的上下游引物各 0.4 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，DNA模板約為50 ng，5 U 的DNA 聚合酶0.2 μl。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性 94 ℃ 3 min，變性 94 ℃1 min，退火 57 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 50 s，共計(jì)35個循環(huán)，最后延伸 72 ℃ 10 min，反應(yīng)結(jié)束后于4 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳，對目的片段進(jìn)行檢測和分析。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物SSCP檢測 取上述PCR產(chǎn)物3 μl加入7 μl的考馬斯上樣緩沖液中，進(jìn)行98 ℃變性10 min；冰浴 10 min。經(jīng)14 %非變性聚丙烯酰胺凝膠（Arc：Bis= 37.5∶1），250 V，4 ℃電泳 35 h，通過銀染法顯色并照相記錄和辨別分型。經(jīng)SSCP分析和辨型后，利用瓊脂糖凝膠進(jìn)行目的條帶的純化，利用回收試劑盒回收不同基因型個體的PCR產(chǎn)物[12]。

1.2.4 克隆及測序 回收后的目的DNA片段進(jìn)行pGEM-T Easy載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Scherichiacoli）DH5α菌株，挑選10個優(yōu)質(zhì)菌落培養(yǎng)，菌液經(jīng)PCR擴(kuò)增和14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（Arc：Bis= 37.5∶1）電泳（250 V，4℃，35 h），對各個樣本和基因型鑒定后送北京華大公司進(jìn)行測序和鑒定。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 通過Dnasp 4.0軟件分析核苷酸變異位點(diǎn)、氨基酸變異位點(diǎn)以及單倍型[13]；采用Clustal X 軟件對核苷酸及氨基酸同源序列進(jìn)行比對分析[14]；利用MEGA 3.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]；SPSS 17.0軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增合作豬DRB基因第三外顯子

合作豬DRB基因第三外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳（見圖 1），獲得了一條清晰且特異性較好條帶，其大小約為330 bp，與預(yù)期目的片段大小一致。說明該結(jié)果可進(jìn)行下一步的SSCP分析。

圖1 合作豬DRB基因第3外顯子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 合作豬DRB基因第三外顯子PCR-SSCP檢測

合作豬DRB基因第三外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測進(jìn)行辨型（見圖2），將不同基因型的個體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后克隆其序列。以菌液和基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后。其產(chǎn)物進(jìn)行SSCP比較分析，取上述結(jié)果一致的產(chǎn)物進(jìn)行測序。圖2所示為最終確定的測序菌落PCR產(chǎn)物及其SSCP 檢測結(jié)果。菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測的條帶均發(fā)現(xiàn)重復(fù)，并與基因組DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)SSCP檢測結(jié)果中尋得對應(yīng)的條帶。根據(jù)上述辨型結(jié)果，對菌液進(jìn)行測序，以確定不同的等位基因。

圖2 合作豬DRB基因第3外顯子菌液PCR-SSCP檢測

2.3 合作豬DRB基因第三外顯子克隆和測序

合作豬DRB基因外顯子3菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)北京六合華大基因公司測序，結(jié)果如圖3所示。所得測序結(jié)果未出現(xiàn)套峰及雜峰現(xiàn)象，可用于核苷酸序列分析。通過對286頭合作豬DRB基因第三外顯子進(jìn)行PCR-SSCP、克隆、測序和序列比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DRB基因第三外顯子存在15個特異性的單倍型序列。

圖3 DRB基因第3外顯子菌液測序結(jié)果

2.4 合作豬DRB基因第三外顯子多態(tài)位點(diǎn)和等位基因差異分析

286頭合作豬共檢測到15個等位基因，分別定義為S1～S15，DRB第三外顯子的15個單倍型序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)與其同源性為98.94%；隨后核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)了21個變異位點(diǎn)，占分析位點(diǎn)的7.45%；其中16個轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，約為變異位點(diǎn)的76.19%，其中G/A的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)7個，T/C的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)9個。顛換位點(diǎn)5個，約為變異位點(diǎn)的23.81%，其中G/C的顛換3個，A/T的顛換2個。結(jié)果表明DRB第3外顯子的變異中核苷酸轉(zhuǎn)換變異占比較大。本試驗(yàn)獲得的15個單倍型序列與GenBank中豬DRB序列（登錄號：FJ905840.1）比對發(fā)現(xiàn)其差異較大（見圖 4）。

圖4 合作豬DRB基因第三外顯子等位基因核苷酸比對結(jié)果

2.5 等位基因系統(tǒng)發(fā)育分析

利用ClustalX軟件對合作豬DRB基因外顯子3的序列構(gòu)建進(jìn)化樹（見圖 5）。結(jié)果顯示合作豬DRB基因第3外顯子序列系統(tǒng)樹未呈現(xiàn)大的分支現(xiàn)象，全為細(xì)小分支。結(jié)合核苷酸序列比對結(jié)果，推斷DRB基因可能是由同一等位基因突變分化而來的。

圖5 合作豬 DRB基因第三外顯子核苷酸序列的NJ進(jìn)化樹

3 討論

合作豬是我國甘肅省南部甘南地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)豬品種，是世界上高海拔放牧的豬種之一，具有較強(qiáng)的抗逆性、其肉質(zhì)鮮嫩[16]、飼料利用率高等多個特點(diǎn)。目前合作豬相關(guān)基因的研究主要涉及其生長和發(fā)育、抗病性狀、繁殖性狀等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因。本研究利用PCR-SSCP技術(shù)對286頭合作豬的DRB基因第3外顯子進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性極豐富，共發(fā)現(xiàn)15個等位基因。經(jīng)核苷酸序列比對分析，結(jié)果顯示合作豬DRB基因第3外顯子15個等位基因與豬同源性達(dá)到98.94%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)21個突變位點(diǎn)且單個等位基因變異位點(diǎn)數(shù)量較少，說明DRB基因第3外顯子序列相對比較穩(wěn)定，推斷合作豬群體生活環(huán)境變化不大。等位基因系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹未出現(xiàn)較大分支，全為細(xì)小分支，恰好與核苷酸序列比對中單個等位基因突變位點(diǎn)較少相一致。推斷合作豬DRB基因最初可能是由同一個等位基因發(fā)生細(xì)微突變，發(fā)育而來的。本研究結(jié)果為解析合作豬SLA基因與個體表型差異和遺傳相關(guān)性提供參考，也為地方優(yōu)質(zhì)品種保護(hù)和選育提供依據(jù)。