李自昂，王帆，王曉月，王倩，程潔，林軍

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430072)

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是一種極度惡性腫瘤，5年存活率<7%，中位生存期約為6個月，預(yù)后差[1-2]。PDAC能夠顯示出很大的細胞異質(zhì)性，具有明顯的上皮和間充質(zhì)癌細胞群，在PDAC小鼠模型中，白血病抑制因子可以通過調(diào)節(jié)癌細胞分化和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化狀態(tài)促進癌癥進展，而在PDAC患者中，間皮素高表達患者的中位生存期明顯短于低表達者，表明間皮素能夠促進胰腺癌的進展[3-5]。由于早期廣泛轉(zhuǎn)移和對化療藥物的耐藥作用，PDAC的死亡率較高[6]。有研究表明，免疫調(diào)節(jié)細胞(如髓樣來源的抑制細胞)在腫瘤發(fā)展和化學(xué)耐藥中起重要作用[7]。預(yù)計到2030年，PDAC將成為所有惡性腫瘤中的第二大常見癌癥類型[8]，但目前對該病的研究較少。因此，迫切需要尋找新的生物標(biāo)志物，能夠預(yù)測PDAC的預(yù)后并作為PDAC潛在的治療靶點及檢測手段。本研究主要篩選與PDAC發(fā)展高度相關(guān)并影響其預(yù)后的基因，以期為未來研究胰腺癌進展途徑及靶向治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1微陣列數(shù)據(jù)集來源 從GEO(Gene expression omnibus)在線數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取4個基因數(shù)據(jù)集[GSE(gene series expression)28735、GSE62165、GSE62452、GSE71989]和2個微RNA(microRNA,miRNA)數(shù)據(jù)集(GSE25820、GSE41372)。使用R 3.6.1中的程序包“l(fā)imma”讀取，標(biāo)準(zhǔn)化和篩選差異表達的基因[9]。篩選|logFC|≥1且調(diào)整后P<0.05的基因作為差異基因。利用FunRich軟件篩選均在各數(shù)據(jù)集差異表達的基因和miRNA[10]。

1.2基因本體論(gene ontology，GO)富集通路和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析 使用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID)(https://david.ncifcrf.gov/)進行差異基因GO富集和KEGG通路分析[11]。高度富集于信號通路[偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05]的基因被認(rèn)為參與PDAC的生物代謝途徑。R3.6.1的“GOplot”包用于可視化富集通路[12]。

1.3蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)和模塊的構(gòu)建 采用String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析基因間的相互作用[13-14]。Cytoscape及其包含的功能組件MCODE(Molecular complex detection)用于構(gòu)建可視化PPI網(wǎng)絡(luò)并分析不同的生物模塊[15-16]。

1.4miRNA靶基因的預(yù)測和預(yù)后分析 采用miRwalk網(wǎng)站(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和miRNet網(wǎng)站(https://www.mirnet.ca/)構(gòu)建miRNA-基因互作網(wǎng)絡(luò)[17-18]。綜合差異基因、富集分析、miRNA靶基因篩選基因，并使用UCSC Xena在線工具(http://xena.ucsc.edu/)構(gòu)建基因的表達聚類圖[19]。最后，使用Kaplan-Meier plot網(wǎng)站(http://kmplot.com/)評估這些基因?qū)DAC的臨床預(yù)后[20]。該網(wǎng)站根據(jù)基因中位表達水平分為高、低表達組，進而分析兩組5年生存率的差異。

2 結(jié) 果

2.1差異表達基因和差異表達miRNA GSE28735數(shù)據(jù)集包括45個腫瘤組織和45個相鄰正常組織。GSE62165數(shù)據(jù)集包含118個PDAC腫瘤組織和13個非腫瘤組織。GSE62452數(shù)據(jù)集包括69個胰腺腫瘤和61個相鄰的正常組織。GSE71989數(shù)據(jù)集包含8個正常胰腺組織和14個PDAC組織。GSE25820數(shù)據(jù)集的miRNA表達譜包括4個正常胰腺導(dǎo)管細胞，4個腺泡細胞，5個慢性胰腺炎和原發(fā)性PDAC的轉(zhuǎn)移組織。GSE41372數(shù)據(jù)集包含15個非腫瘤樣品和15個腫瘤樣品。從4個數(shù)據(jù)集中共獲得217個差異基因，見圖1；從2個miRNA數(shù)據(jù)集中獲得13個miRNA(hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-216a、hsa-miR-217、hsa-miR-145、hsa-miR-302c、hsa-miR-100、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-770-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-1236、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-196a)，見圖2。

圖1 4個基因數(shù)據(jù)集差異表達基因

圖2 2個miRNA數(shù)據(jù)集差異表達miRNA

2.2GO富集和KEGG通路分析 DAVID數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)217個基因高度富集于8個生物學(xué)過程：細胞外基質(zhì)組織、膠原分解代謝過程、細胞黏附、細胞外基質(zhì)分解、蛋白水解、骨骼系統(tǒng)發(fā)育、膠原纖維組織、內(nèi)胚層細胞分化，見圖3；8個細胞成分通路：細胞外空間、細胞外區(qū)域、細胞外基質(zhì)、細胞外泌體、蛋白質(zhì)細胞外基質(zhì)、細胞表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和膠原三聚體，見圖4；5個分子功能通路：細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、整聯(lián)蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合、膠原蛋白結(jié)合，見圖5；4個KEGG通路：蛋白質(zhì)的消化吸收、細胞外基質(zhì)-受體相互作用、胰腺分泌、黏著斑，見圖6。

圖3 8個重要的生物學(xué)過程

圖4 8個重要的細胞成分

圖5 5種重要的分子功能

KEGG：京都基因與基因組百科全書

2.3PPI基因網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和預(yù)后分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫共獲得150個上調(diào)基因和67個下調(diào)基因。連接系數(shù)高于0.4的167個差異基因被用來構(gòu)建PPI基因網(wǎng)絡(luò)互作圖。從這些互作基因中分析出10個重要的模塊，見圖7。在miRwalk數(shù)據(jù)庫中分析了6 711個miRNA靶基因。通過miRNA-基因網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中鎂依賴性蛋白磷酸酶1δ(protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta,PPM1D)是3個miRNA(hsa-miR-342-3p、hsa-miR-217、hsa-miR-770-5p)的共同靶點，見圖8。篩選出10個與PDAC顯著相關(guān)的基因，在UCSC xena數(shù)據(jù)庫中，從癌癥基因組數(shù)據(jù)集提取出4例正常樣本和177例腫瘤樣本，篩選出的10個基因均差異表達于腫瘤組織與非腫瘤組織(P<0.05,|logFC|>1)，見圖9。Kaplan-Meier plot網(wǎng)站收集了172例PDAC患者的臨床信息用于進行生存分析，總生存期設(shè)定為7 642 d，生存曲線顯示，纖連蛋白Ⅰ(fibronectin 1，F(xiàn)N1)、血小板反應(yīng)蛋白2型(thrombospondin 2,THBS2)、Ⅻ 型膠原蛋白α-1鏈(collagen type Ⅻ alpha 1 chain，COL12A1)、Ⅵ 型膠原蛋白α-3鏈(collagen type Ⅵ alpha 3 chain，COL6A3)和載脂蛋白L1型(apolipoprotein L1，APOL1)高表達組患者的生存率較低，而PPM1D高表達組患者的生存率較高，見圖10～15。

PPI:蛋白質(zhì)相關(guān)作用；紅色節(jié)點代表上調(diào)基因，藍色節(jié)點代表下調(diào)基因，線條代表每個基因之間相互作用

黃色節(jié)點代表miRNA，藍色節(jié)點代表基因，紅色節(jié)點代表PPM1D基因

FN1：纖連蛋白Ⅰ；IGFBP5:胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5；CDH11:鈣黏蛋白11；THBS2：血小板反應(yīng)蛋白2型；COL12A1：Ⅻ型膠原蛋白α-1鏈；COL5A2：Ⅴ型膠原蛋白α-2鏈；CP:外殼蛋白；APOL1：載脂蛋白L1型；COL6A3：Ⅵ型膠原蛋白α-3鏈；PPM1D：鎂依賴性蛋白磷酸酶1δ；紅色表示該基因在樣本中高表達，藍色表示該基因在樣本中低表達；在樣本組中，灰色表示正常組，黃色表示腫瘤組

PPM1D：鎂依賴性蛋白磷酸酶1δ

FN1：纖連蛋白Ⅰ

THBS2：血小板反應(yīng)蛋白2型

COL12A1：Ⅻ型膠原蛋白α-1鏈

COL6A3：Ⅵ型膠原蛋白α-3鏈

APOL1：載脂蛋白L1型

3 討 論

miRNA是一個小的非編碼調(diào)控RNA的大家族[21]。它們控制人類60%以上的蛋白質(zhì)編碼和基因表達[22]。miRNA參與PDAC發(fā)展過程中的大多數(shù)遺傳突變，如幾乎所有PDAC病例中，miRNA介導(dǎo)的KRAS突變激活是胰腺導(dǎo)管上皮細胞轉(zhuǎn)化為腺癌的最早的遺傳變化[23]。這說明miRNA能夠通過調(diào)控基因活動參與癌癥的發(fā)展。我國胰腺癌導(dǎo)致的死亡在癌癥相關(guān)死亡中占比從2009—2019年增加了9%，因為人口老齡化及生活飲食等因素影響，這一比例還會繼續(xù)上升[24]。因此，對胰腺癌的機制進行研究將成為今后研究的重點。

本研究基于公眾數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)miR-342-3p、miR-217、miR-199b-5p,miR-770-5p調(diào)控的基因THBS2、FN1、COL12A1在胰腺癌組織中高表達，PPM1D、COL6A3、APOL1在胰腺癌組織中低表達。在功能富集方面，這些基因顯著富集于膠原分解代謝途徑、細胞黏附、細胞外泌體、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性和細胞外基質(zhì)受體相互作用等通路。Kaplan-Meier曲線顯示，PPM1D、FN1、THBS2、COL12A1、COL6A3、APOL1表達與PDAC患者的預(yù)后顯著相關(guān)。PPM1D編碼的蛋白質(zhì)是玉米2C型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族的成員。該基因的表達以p53依賴的方式響應(yīng)各種環(huán)境壓力而被誘導(dǎo)[25-26]。PPM1D通過下調(diào)凋亡刺激p53蛋白2增強Wnt/β聯(lián)蛋白途徑，促進胰腺癌細胞遷移和侵襲[27]。FN1編碼纖連蛋白，是糖蛋白的一種，在血漿中以可溶性二聚體的形式存在，在細胞表面和細胞外基質(zhì)中以二聚體或多聚體形式存在。纖連蛋白參與細胞黏附和遷移過程，包括胚胎發(fā)生、傷口愈合、血液凝固、宿主防御和轉(zhuǎn)移[28-29]。在切除的PDAC組織中，F(xiàn)N1高表達于腫瘤瘤體更大且遠端淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織[30]。THBS2編碼的蛋白質(zhì)屬于血小板反應(yīng)蛋白家族，是二硫鍵連接的同型三聚體糖蛋白，介導(dǎo)細胞與細胞之間以及細胞與基質(zhì)之間的相互作用[31]。臨床研究表明，PDAC的血清THBS2水平顯著高于高危人群，并且該基因在預(yù)后較差的患者中表達水平更高[32]。COL12A1編碼Ⅻ型膠原蛋白的α鏈，是具有三重螺旋間斷的原纖維相關(guān)膠原蛋白。Ⅻ型膠原蛋白是與Ⅰ型膠原蛋白結(jié)合的同型三聚體[33]。目前關(guān)于COL12A1與PDAC進展相關(guān)的研究較少。但有研究表明，COL12A1通過促分裂原活化的蛋白激酶通路維持的正反饋促進胃癌細胞的轉(zhuǎn)移[34]。COL6A3是Ⅵ型膠原蛋白編碼的α-3鏈，這是Ⅵ型膠原蛋白(在大多數(shù)結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn)的珠狀細絲膠原蛋白)的三個α鏈之一。Ⅵ型膠原基因突變與Bethlem肌病有關(guān)，Bethlem肌病是一種罕見的常染色體顯性遺傳性近端肌病，伴有兒童早期發(fā)作[35]。Kang等[36]研究表明，COL6A3在胰腺癌組織及胰腺癌患者血清中顯著高表達，表明該基因參與PDAC的發(fā)生發(fā)展。APOL1編碼與載脂蛋白A-1結(jié)合的高密度脂蛋白。載脂蛋白A-1是一種相對豐富的血漿蛋白，是高密度脂蛋白的主要載脂蛋白。它參與血漿中大多數(shù)膽固醇酯的形成，并促進膽固醇從細胞中流出。APOL1能夠?qū)е履I損傷并且在腎臟足細胞中高表達，但損傷的具體機制仍不明確[37]。胰腺癌血清中APOL1基因表達水平顯著高于普通人群，受試者工作特征曲線結(jié)果顯示其可能成為PDAC的診斷標(biāo)志物[38]。

綜上所述，10個miRNA靶基因在PDAC與正常組織中差異表達并參與其發(fā)生發(fā)展，其中PPM1D、FN1、THBS2、COL12A1、COL6A3和APOL1與PDAC預(yù)后相關(guān)。因此，進一步研究這些基因在胰腺癌中的作用，可能是治療胰腺癌，提高患者生存率的重要方向。