肖正午，肖 莉，傳 軍，李亞梅，彭 壯，林麗美，李 凱，戴愛國(guó)，庹勤慧*，廖端芳*

(1.湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州 215004；3.人和未來生物科技長(zhǎng)沙有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410000；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸疾病研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

對(duì)病原體的基因檢測(cè)是感染性疾病確診的關(guān)鍵指標(biāo)之一。根據(jù)病原體在機(jī)體內(nèi)繁殖部位的不同，采集生物標(biāo)本的方式相對(duì)應(yīng)有所差異，包括采集各種體液(如血液、腦脊液、痰液、尿液)以及直接采集細(xì)胞(如咽喉拭子、宮頸刮片)等。一般情況下，由于病原體在感染人體后有較快速和較大量的繁殖，敏感性一般不是制約基因檢測(cè)的關(guān)鍵因素，但對(duì)特定種類的病毒如SARS-CoV-2，由于其感染的部位特點(diǎn)，檢測(cè)敏感性顯得尤為重要。

2019年底發(fā)生的COVID-19大流行，其嚴(yán)重程度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了醫(yī)學(xué)界的預(yù)期。觀察發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2主要在下呼吸道繁殖，上呼吸道細(xì)胞內(nèi)的病毒拷貝數(shù)相對(duì)較低[1-2]。因此，導(dǎo)致以咽喉拭子作為檢測(cè)標(biāo)本的SARS-CoV-2基因檢測(cè)假陰性比例相對(duì)偏高[3]。而假陰性的真陽(yáng)性個(gè)體，無論是對(duì)患者的治療，還是對(duì)無癥狀感染者的追蹤朔源，都是新冠疫情防治中需要克服的重要節(jié)點(diǎn)。近期，國(guó)際上一些國(guó)家和地區(qū)再度出現(xiàn)的聚集性感染，特別是一些不可溯源的病例，極有可能是由于現(xiàn)有核酸檢測(cè)方法的敏感性不夠(假陰性比例相對(duì)偏高)，導(dǎo)致一些無癥狀感染者沒能及時(shí)被發(fā)現(xiàn)所致。

目前臨床上采用的SARS-CoV-2檢測(cè)試劑盒，主要技術(shù)原理為二代測(cè)序，基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)PCR，基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)的實(shí)時(shí)PCR和基于Cas核酸酶的檢測(cè)[4-7]。在檢測(cè)靶點(diǎn)上，大部分選擇1～2個(gè)靶點(diǎn)[8-10]。靶點(diǎn)的數(shù)量和探針的多少，一定程度上除決定檢測(cè)的特異性外，更對(duì)檢測(cè)的敏感性有直接的影響。本研究從生物信息學(xué)分析入手，并采用重疊PCR合成方法，選擇了可用于SARS-CoV-2檢測(cè)的8個(gè)新靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)在擴(kuò)增引物和適宜于TaqMan探針檢測(cè)兩方面均呈現(xiàn)出很好的的SARS-CoV-2特異性。有望成為未來SARS-CoV-2高靈敏度檢測(cè)方法及試劑盒開發(fā)的重要對(duì)象。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所有寡核苷酸包括引物、模板片段、TaqMan探針均由上海生工合成。PCR所用聚合酶購(gòu)自上海生工公司的Taq Mix。

1.2 方法

1.2.1 SARS-CoV-2特異性序列比對(duì)采用如下策略

(1)選定代表序列；(2)提取近源序列；(3)從病毒序列數(shù)據(jù)庫(kù)排除代表序列和近源序列，作為非近源序列；(4)利用blast局部比對(duì)將代表序列與近源序列進(jìn)行比對(duì)；(5)根據(jù)比對(duì)結(jié)果提取非同源保守區(qū)域；(6)利用blast局部比對(duì)將代表序列與非近源序列進(jìn)行比對(duì)；(7)根據(jù)比對(duì)結(jié)果提取同源保守區(qū)域；(8)綜合排除非同源保守區(qū)域與同源保守區(qū)域，得到該物種的特異性保守區(qū)域；(9)選擇合適的特異性保守區(qū)域作為模板，用來設(shè)計(jì)引物及探針。

1.2.2 SARS-CoV-2特異性引物設(shè)計(jì)采用如下策略

(1)選擇refseq數(shù)據(jù)庫(kù)中的新型冠狀病毒序列作為代表序列；(2)選擇其它新型冠狀病毒株的完整序列作為近源序列；(3)從病毒序列數(shù)據(jù)庫(kù)排除SARS-CoV-2相關(guān)序列，作為非近源序列；隨后的6個(gè)步驟與SARS-CoV-2特異性序列比對(duì)步驟(4)～(9)相同。模板片段設(shè)計(jì)為側(cè)翼含有相應(yīng)擴(kuò)增引物的特異性序列和中間包含至少可以設(shè)計(jì)一個(gè)TaqMan探針的特異性序列。其中引物序列長(zhǎng)度不短于20個(gè)堿基，探針長(zhǎng)度不短于23個(gè)堿基。

擬合成和測(cè)試的SARS-CoV-2靶點(diǎn)片段采用重疊PCR合成。各片段重疊堿基為18個(gè)或以上。根據(jù)選取的靶點(diǎn)長(zhǎng)度，分別合成4～5個(gè)片段用于重疊PCR，重疊PCR采用一步法或多步法。重疊PCR合成的產(chǎn)物最后送測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1 8個(gè)SARS-CoV-2特異性模板序列和相應(yīng)探針序列的確定

表1列出了8個(gè)SARS-CoV-2特異性模板序列，用于重疊PCR的寡核苷酸片段和可用于熒光定量PCR的TaqMan探針及用于熒光定量PCR的引物。從表1可見，這些模板片段長(zhǎng)度在100～300堿基之間，是熒光定量PCR擴(kuò)增元的適宜長(zhǎng)度；片段側(cè)翼含有連續(xù)18個(gè)以上的特異性序列；片段中含有至少一個(gè)可用于TaqMan探針設(shè)計(jì)、連續(xù)長(zhǎng)度等于或大于23個(gè)堿基的SARS-CoV-2特異性序列。

表1 8個(gè)SARS-CoV-2特異性模板序列、引物和探針序列

2.2 8個(gè)SARS-CoV-2特異性模板片段的重疊PCR合成

模板序列5和6采用一步法合成，分別以兩段模板片段為DNA模板各1 μL加入PCR反應(yīng)體系，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，補(bǔ)水至總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。其PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1a。

模板序列1，2，3，4，7和8采用多步法合成。第一步分別以1號(hào)2號(hào)兩段模板片段為DNA模板各1 μL加入PCR反應(yīng)體系，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，補(bǔ)齊水至總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 15 s，52 ℃ 25 s，72 ℃ 10 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。將第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10000倍作為第二步PCR的模板，并加入3號(hào)和4號(hào)模板片段各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，補(bǔ)齊水至總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 15 s，52 ℃ 25 s，72 ℃ 10 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。以此類推，將第二步PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10 000倍作為第三步PCR的模板，最終擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物序列，分步結(jié)果見圖1b～d。8個(gè)SARS-CoV-2特異性模板序列最終產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1e。

將8個(gè)SARS-CoV-2特異性模板序列送上海生工進(jìn)行Sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示均與預(yù)期結(jié)果相符(見圖2)。

圖1 8個(gè)SARS-CoV-2特異性模板片段重疊PCR合成電泳結(jié)果圖a:PCR一步法合成模板5和6的結(jié)果電泳圖；b:模板1，2，3，4，7，8分步法第一次連接電泳圖，連接成功之后的片段約100bp左右；c:模板1，2，3，4，7，8分步法第二次連接圖，連接成功之后的片段約為150bp左右；d:模板1，2，3，4，7，8分步法第三次連接圖，連接成功之后的片段約為200bp左右;e:SARS-CoV-2特異性模板序列1-8最終產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 8個(gè)SARS-CoV-2特異性模板序列一代測(cè)序結(jié)果圖a～h所示為8個(gè)SARS-CoV-2特異性模板序列中TaqMan探針的部分測(cè)序序列結(jié)果

2.3 SARS-CoV-2合成模板用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的可行性分析

重疊PCR合成的8個(gè)SARS-CoV-2模板序列，利用相應(yīng)的TaqMan探針檢測(cè)分析其用于熒光定量PCR的可能性。熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：2×Taq qPCR Master Mix 10 μL，SARS-CoV-2模板序列5 μL，探針工作液2 μL，補(bǔ)齊水至總體積20 μL。其中探針工作液包含正向、反向引物，和十分之一濃度的探針引物。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，延伸步驟收集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。其PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3。

結(jié)果如圖3所示，8個(gè)模板片段序列均能被相應(yīng)的探針有效檢測(cè)，在使用模板拷貝數(shù)為300拷貝時(shí)，其Ct值大都位于21～24之間。

圖3 SARS-CoV-2探針檢測(cè)特異性模板的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖a:1號(hào)探針的工作曲線；b:2探針的工作曲線;c:3號(hào)探針的工作曲線；d:4號(hào)探針的工作曲線

2.4 SARS-CoV-2合成模板拷貝數(shù)與探針量效關(guān)系

模板1和模板8進(jìn)一步進(jìn)行了不同拷貝數(shù)的量效關(guān)系檢測(cè)。取起始拷貝數(shù)約為105cp/μL的SARS-CoV-2合成模板1 μL，依次按30倍、100倍、300倍、1 000倍、3 000倍、10 000倍等比稀釋，分別加入TaqMan探針檢測(cè)的熒光定量PCR反應(yīng)體系中。qPCR擴(kuò)增結(jié)果均表現(xiàn)為隨著模板拷貝數(shù)增加，Ct值下降的良好關(guān)系(表2，圖4)

表2 SARS-CoV-2合成模板1和8拷貝數(shù)與探針qPCR擴(kuò)增的Ct數(shù)值

圖4 SARS-CoV-2合成模板拷貝數(shù)與探針量效關(guān)系的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線圖

3 討 論

傳染病的實(shí)驗(yàn)室診斷屬于病因診斷的范疇。傳統(tǒng)的病因診斷包括病原體的培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、抗原抗體檢測(cè)等。基因檢測(cè)為抗原檢測(cè)，在特異性上較其它實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段具有一定優(yōu)勢(shì)。然而，基因檢測(cè)優(yōu)勢(shì)的實(shí)現(xiàn)有賴于病原體靶點(diǎn)的選擇，即靶點(diǎn)的特異性和靶點(diǎn)的數(shù)量。鑒于現(xiàn)有SARS-CoV-2基因檢測(cè)試劑盒存在較高假陰性和低陽(yáng)性率[3，8-10]，本文針對(duì)該病毒的序列進(jìn)行可檢測(cè)靶點(diǎn)的研究，獲得了8種可用于靶點(diǎn)的序列片段，并采用重疊PCR人工合成和通過設(shè)計(jì)TaqMan探針，驗(yàn)證了這8個(gè)序列片段作為實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的可行性。

從表1可以看出，本文選擇的8個(gè)靶點(diǎn)片段，在SARS-CoV-2基因組上分布相對(duì)較廣，為其作為基因檢測(cè)靶點(diǎn)時(shí)避免基因降解和基因局部二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致假陰性提供了可能性。另外，相對(duì)廣泛和互不連續(xù)的靶點(diǎn)序列，也為多靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒的研發(fā)時(shí)呈現(xiàn)不同靶點(diǎn)單獨(dú)形成擴(kuò)增單元而不互相干擾提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本研究雖然只從一個(gè)靶點(diǎn)、一個(gè)探針的層面對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行了其實(shí)用性的初步研究，但這些靶點(diǎn)在SARS-CoV-2基因組上相對(duì)分散的序列位置，使這些靶點(diǎn)可望成為多重實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的良好候選對(duì)象。

本研究基于TaqMan探針確認(rèn)和人工合成SARS-CoV-2 8個(gè)可用于基因檢測(cè)的新靶點(diǎn)，并利用TaqMan探針驗(yàn)證了這些靶點(diǎn)的可行性。雖然這些靶點(diǎn)的片段長(zhǎng)度相對(duì)較短，但其保守性相對(duì)較高，大部分均含有6個(gè)或以上連續(xù)20個(gè)堿基的序列片段，從而使這些片段同樣可以作為L(zhǎng)AMP原理的基因檢測(cè)靶點(diǎn)?；贑as酶的基因檢測(cè)對(duì)靶點(diǎn)要求不高[7，11]，可以預(yù)期這些靶點(diǎn)片段能完全用于開發(fā)基于Cas酶的基因檢測(cè)。

綜上所述，本文通過生物信息學(xué)比對(duì)，在現(xiàn)有SARS-CoV-2檢測(cè)靶點(diǎn)之外，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有可用于基于TaqMan原理的新靶點(diǎn)。在采用重疊PCR合成之后，利用TaqMan探針開展了一探針、一靶點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR驗(yàn)證，確認(rèn)了這些靶點(diǎn)作為SARS-CoV-2基因檢測(cè)靶點(diǎn)的可行性。由于這些靶點(diǎn)同時(shí)還能作為基于Cas酶原理的檢測(cè)和基于LAMP原理的檢測(cè)，因而這些基因片段，為研發(fā)新的更高敏感性的SARS-CoV-2檢測(cè)試劑盒提供了多種可供選擇的靶點(diǎn)，尤其是對(duì)多重實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的研發(fā)，價(jià)值尤為顯著。