王 娟，潘 鑫，徐永茂

(陸軍第七十一集團軍醫(yī)院 1. 血液內(nèi)分泌科,2.腫瘤血液科,江蘇 徐州 221009)

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]，5年生存率低于15%[2]。肺癌中約85%為非小細胞肺癌[3]。診斷生物標(biāo)記物的使用可以幫助識別早期非小細胞肺癌患者，無創(chuàng)且易于評估的液體活檢成為新生物標(biāo)志物的來源[4]。外泌體是衍生自多囊泡體的小膜囊泡，通過胞吐作用將其組成性地或在細胞活化后釋放到細胞外空間中[5]。外泌體包含來自其起源細胞的生物活性物質(zhì)，包括核酸和蛋白質(zhì)，并且已經(jīng)表明它們可能在細胞間通訊中發(fā)揮作用[6]。Sandfeld-Paulsen B等人[7]通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌患者血清外泌體內(nèi)紐約食管鱗狀細胞癌抗原-1(New York-esophageal-1,NY-ESO-1),Alix,胎盤堿性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，PLAP)的表達水平明顯高于健康志愿者。但是血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP是否能夠應(yīng)用于非小細胞肺癌患者的診斷仍需探索。本文針對上述三種標(biāo)記物在非小細胞肺癌患者的診斷中的價值進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2018年2月至2020年2月本院收治的早期非小細胞肺癌(Ⅰ期和Ⅱ期)患者100例為肺癌組；男65例，女35例；年齡27～68歲；平均年齡(52.53±24.64)歲。納入同期本院收治的肺部良性患者100例作為良性組；男61例，女39例；年齡34～81歲；平均年齡(55.32±23.05)歲。其中，肺炎性假瘤50例，間質(zhì)性肺炎22例，肺結(jié)核10例，肺膿腫8例，鈣化結(jié)節(jié)5例，炎性結(jié)節(jié)5例。非小細胞肺癌患者100例和肺部良性疾病患者100例均經(jīng)本院診斷證實。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者；②長期使用皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑者；③患有精神疾病者；④患有其他癌癥者。同時，納入同期在本院體檢的健康者100例為對照組；男64例，女36例；年齡33～79歲；平均年齡(54.65±26.10)歲。各組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 外泌體的分離和蛋白的檢測

采取早期非小細胞肺癌患者、肺部良性疾病患者、體檢健康者的清晨肘前靜脈血6 mL。使用廣州捷威斯生物科技有限公司的外泌體純化試劑盒(BB-3951-1)進行外泌體的分離。將分離的外泌體超聲破膜后，以酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達量。以CD63作為內(nèi)參。CD63檢測試劑盒購自廣州杰特偉生物科技有限公司(貨號：E9307h)。NY-ESO-1檢測試劑盒購自北京啟維益成科技有限公司(貨號：abx433062)。Alix檢測試劑盒購自北京百諾威生物科技有限公司(貨號：ABC1435)。PLAP檢測試劑盒購自上海機純實業(yè)有限公司(貨號：ml000475)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料滿足方差齊性和正態(tài)分布，多組間比較采用one-way ANOVA檢驗。應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分析NY-ESO-1,Alix,PLAP檢測非小細胞肺癌的臨床診斷價值。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平

三組受試人員血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平存在顯著差異(P<0.05)，且NY-ESO-1,Alix,PLAP分別在肺癌組中的表達高于良性組和對照組，良性組又高于對照組，說明血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平與腫瘤的惡性程度有關(guān)，見表1。

表1 三組受試者血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平 (ng/L)

2.2 早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

為了評估血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP在早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者中的診斷價值，繪制100例早期非小細胞肺癌患者和100例肺部良性疾病患者的ROC曲線(圖1)。NY-ESO-1的陽性臨界值189.1(ng/L)，其診斷靈敏度為98%，特異度為78%；以Alix的陽性臨界值633.1(ng/L)，其診斷靈敏度為95%，特異度為80%；以PLAP的陽性臨界值45.42(ng/L)，其診斷靈敏度為90%，特異度為90%。Alix曲線下面積大于NY-ESO-1和PLAP，說明就單向診斷而言，早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者血清外泌體中Alix診斷的效能高于NY-ESO-1和PLAP。見圖1和表2。

圖1 早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

2.3 早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

為了評估血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP在早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者中的診斷價值，繪制100例早期非小細胞肺癌患者和100例健康體檢者的ROC曲線(圖2)。以NY-ESO-1的陽性臨界值91.03(ng/L)，其診斷靈敏度為95%，特異度為95%；以Alix的陽性臨界值367.8(ng/L)，其診斷靈敏度為94%，特異度為95%；以PLAP的陽性臨界值7.197(ng/L)，其診斷靈敏度為95%，特異度為92%。NY-ESO-1曲線下面積大于Alix和PLAP，說明就單向診斷而言，早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者血清外泌體中NY-ESO-1診斷的效能高于Alix和PLAP。見圖2和表3。

圖2 早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

表2 早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

表3 早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者血清外泌體ROC曲線、靈敏度、特異度

2.4 血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP對非小細胞肺癌的聯(lián)合診斷

患有非小細胞肺癌的為真陽性，未患有非小細胞肺癌的為真陰性。以NY-ESO-1的陽性臨界值189.1(ng/L)、Alix的陽性臨界值633.1(ng/L)、PLAP的陽性臨界值45.42(ng/L)為診斷界限，三者全滿足者為聯(lián)合診斷陽性。血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP聯(lián)合對非小細胞肺癌的診斷的的靈敏度為95.00%(95/100)，特異度為91.00%(182/200)，準(zhǔn)確度為92.33%(277/300)。見表4。

表4 血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP對非小細胞肺癌的聯(lián)合診斷

3 討 論

肺癌是全球最常見、最致命的惡性腫瘤[8]。其中，非小細胞肺癌患者占85%，其中5年度生存率仍僅為15%。根據(jù)每年的低劑量計算機X線攝影篩查進行的國家肺癌篩查試驗表明，識別早期肺癌個體有降低死亡率的潛力。但在鑒別良惡性病變有一定的局限性，并且定期進行放射線暴露可能會造成有害影響[9]。因此，開發(fā)特異性和非侵入性生物標(biāo)志物測定對于提高高危人群的識別至關(guān)重要肺癌。在本研究中，分離血液中的外泌體后通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測其中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平，使用ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP聯(lián)合鑒別早期非小細胞肺癌診斷的靈敏度為95.00%，特異度為91.00%，準(zhǔn)確度為92.33%。約登指數(shù)是評價篩查試驗真實性的方法，其數(shù)值越大說明篩查實驗的效果越好，真實性越好。通過ROC曲線，發(fā)現(xiàn)NY-ESO-1,Alix,PLAP的約登指數(shù)均大于0.75，說明具有較好的真實性。本研究聯(lián)合診斷的標(biāo)準(zhǔn)是血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達量均達到陽性臨界值才判斷為聯(lián)合診斷陽性，而單個指標(biāo)的靈敏度和特異度為僅滿足自身的陽性臨界值，因此聯(lián)合檢測組數(shù)據(jù)都小于NY-ESO-1,Alix,PLAP的單個指標(biāo)值。盡管NY-ESO-1,Alix,PLAP均能夠作為非小細胞肺癌的潛在標(biāo)志物，但是其在其他疾病患者的血清外泌體中是否也表達異常仍然未知。如果其它疾病的生物標(biāo)志物是這三者之一，單個指標(biāo)的診斷就會有假陽性的結(jié)果產(chǎn)生。因此，三者均達到陽性臨界值的聯(lián)合診斷能夠減少假陽性的產(chǎn)生。

最近有關(guān)外泌體的研究表明它們可能充當(dāng)癌癥的生物標(biāo)志物。在肺癌中已經(jīng)研究了它們作為診斷性生物標(biāo)志物的用途[10]。然而，僅在少數(shù)針對細胞外囊泡或外泌體miRNA的小型研究中評估了外泌體作為預(yù)后標(biāo)志物的用途[11]。外泌體表面蛋白很可能反映了非小細胞肺癌的病理過程，但是以往的研究尚未研究過外泌體中蛋白的診斷潛力。本研究通過分離受試人員外泌體發(fā)現(xiàn)，3組受試人員血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達水平存在顯著差異(P<0.05)。提示外泌體中的蛋白具有診斷潛力。

NY-ESO-1是在許多實體癌中表達的睪丸癌抗原[12]。有研究評估了非小細胞肺癌組織中NY-ESO-1的基因表達，發(fā)現(xiàn)它存在于15%～30%的肺癌樣本中[13]。Alix，也稱PDCD6IP，在胞質(zhì)分裂的脫落階段，腔內(nèi)內(nèi)體囊泡形成和包膜病毒出芽中在ESCRT途徑內(nèi)起作用[14]。Liu SG等[15]發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中，Alix與非小細胞肺癌風(fēng)險相關(guān)。研究表明，這種蛋白的過度表達可以阻止細胞凋亡[16]。因此，PDCD6IP可能在包括NSCLC在內(nèi)的癌癥發(fā)展中起關(guān)鍵作用。PLAP是一種催化磷酸單酯水解的金屬酶[17]。Wick MR等[18]發(fā)現(xiàn)PLAP在女性苗勒氏癌，腸癌和肺癌中異常表達。本研究發(fā)現(xiàn)血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP鑒別早期非小細胞肺癌患者與肺部良性疾病患者的靈敏度分別為98%、95%和90%，特異度分別為78%，80%，90%。血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP鑒別早期非小細胞肺癌患者與健康體檢者的靈敏度分別為95%，94%，95%，特異度分別為95%，95%，92%。因此，推測血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP對早期NSCLC具有較好的診斷作用。

綜上所述，血清外泌體中NY-ESO-1,Alix,PLAP的表達量檢測可作為診斷早期非小細胞肺癌的潛在標(biāo)志。