曾莎莎，肖玲巧#，唐 瑤，段 潔，張潔雅，李 蕊，郭開云，張 艷*

(南華大學 1.衡陽醫(yī)學院病原生物學研究所，特殊病原體防控湖南省重點實驗室，2.護理學院，湖南 衡陽 421001)

腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白(tumor necrosis factor-α-inducing protein,Tipα)是幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)分泌的一種毒素，因能誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞分泌腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)，故名[1]。胃黏膜上皮細胞表面的核仁素是Tipα的受體，Tipα與核仁素結(jié)合后進入細胞，活化核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路從而誘導(dǎo)TNF-α和趨化因子的分泌，促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Tipα能夠通過白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)信號通路促進胃癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[3]，從而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，但是否還有其它信號通路參與尚不清楚。Wnt/β聯(lián)蛋白(β-catenin)信號通路參與了多種腫瘤細胞的增殖、分化、EMT及侵襲轉(zhuǎn)移等過程[4]，但該信號通路是否參與調(diào)控Tipα誘導(dǎo)的胃癌細胞EMT的形成尚未見報道。本研究旨在探討Wnt/β-catenin信號通路在Tipα誘導(dǎo)的胃癌細胞EMT形成過程中的作用，以進一步闡明Tipα的致病機制，并為H.pylori相關(guān)性疾病的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SGC7901細胞系(中國科學院上海細胞研究所);Tipα原核表達蛋白系課題組前期制備并純化[5]。Trizol(Invitrogen);cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Synthesis Kit(Themoscience);熒光定量試劑盒(天根生化科技有限公司);RIPA Lysis和Extraction Buffer、BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);超敏ECL化學發(fā)光檢測試劑盒(優(yōu)寧維生物科技有限公司);β-catenin、p-β-catenin(Ser675)、p-β-catenin(Ser552)、緊密連接蛋白(Zonula occludens-1,ZO-1)、波形蛋白(Vimentin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、β-actin、c-myc和cyclin D1抗體均購自CST;RT-PCR引物由上海生工合成;其它化學試劑購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和Tipα刺激 采用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱)SGC7901細胞并傳代。待細胞處于對數(shù)生長期時，胰酶消化，調(diào)整細胞密度至108個/L，根據(jù)實驗要求分別接種于6，24或96孔板中。刺激前更換培養(yǎng)基為無FBS的高糖DMEM，根據(jù)課題組前期結(jié)果，以Tipα蛋白最佳刺激濃度和時間(100 μg/mL、12 h)刺激SGC7901細胞，設(shè)置PBS組為陰性對照，每組設(shè)3個復(fù)孔。在進行抑制試驗時，培養(yǎng)板中的細胞先用抑制劑XAV939(1 μmol/L)預(yù)處理1 h，再用Tipα刺激。于不同時間點收集細胞，提取細胞RNA和蛋白用于后續(xù)實驗。

1.2.2 qRT-PCR檢測EMT標志物mRNA表達 Trizol法常規(guī)提取各組細胞總RNA，核酸蛋白儀測定總RNA濃度與純度，鑒定RNA完整性；根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA合成；取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA進行實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)，以β-actin為內(nèi)參；于定量PCR儀上進行循環(huán)擴增，PCR反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性300 s，后以95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 15 s循環(huán)40次。按以下公式計算各基因(E-cadherin、ZO-1、N-cadherin、Vimentin、c-myc和cyclinD1)mRNA表達:目的基因的相對表達量=2-△△CT，其中△△CT=(待測樣本目的基因CT-待測樣本內(nèi)參基因CT)-(對照樣本目的基因CT-樣本內(nèi)參基因CT)。

1.2.3 Western blot檢測EMT標志物及β-catenin磷酸化蛋白 提取各組細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，Western blot檢測EMT標志物(E-cadherin、ZO-1、N-cadherin、Vimentin)、β-catenin(Ser675和S552)、c-myc和cyclinD1的蛋白表達。

1.2.4 免疫熒光檢測β-catenin的核轉(zhuǎn)位 將細胞爬片放入24孔板，接種SGC7901細胞1×105個/孔，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)過夜；用Tipα刺激SGC7901細胞12 h，經(jīng)過4%多聚甲醛固定、0.04% Triton X-100透膜、10%FBS DMEM封閉、PBS洗滌等步驟，加入10% BSA稀釋的β-catenin一抗，4 ℃孵育過夜；PBS清洗細胞爬片5 min×3次；加入10% BSA稀釋的二抗(Cy3標記)和DAPI，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌，在暗室中用熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.5 劃痕實驗 調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，吸取1 mL細胞懸液接種于6孔板，每組3個平行樣本。37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)，直至形成細胞單層。用10 μL Eppendorf Tip在細胞板上劃痕，無血清培養(yǎng)液洗3次，加新鮮無血清培養(yǎng)基，用100 μg/mL Tipα處理細胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h。觀察細胞的遷移情況，于倒置顯微鏡下拍照；計算出Tipα誘導(dǎo)之后與之前劃痕區(qū)間的面積比。

1.2.6 Transwell實驗 取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化，終止消化后吹打混勻，1 000 rpm離心5 min；重懸細胞，使細胞濃度為5×107/mL。在Transwell小室上室加入200 μL不含F(xiàn)BS的高糖DMEM培養(yǎng)基，并在其中接種1×105個SGC7901細胞，以100 μg/mL Tipα刺激；在Transwell小室下室中加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基；常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用鑷子將小室取出，棄去溶液，PBS清洗3次；加入90%的甲醛固定10 min；用棉球輕輕擦去上室中的殘存細胞，注意不要破壞聚碳酸酯膜；用1%結(jié)晶紫染色20 min后，PBS洗滌3次；于倒置顯微鏡下觀察，100倍視野下取5個視野計數(shù)、拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗均獨立重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件，配對組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Tipα對SGC7901細胞β-catenin磷酸化的影響

以Tipα處理SGC7901細胞1、2、4、6 h，提取細胞總蛋白，Western blot檢測細胞β-catenin Ser675和Ser552磷酸化情況，一抗為抗-p-β-catenin(Ser675)和抗-p-β-catenin(Ser552)兔單抗，以β-actin為內(nèi)參。結(jié)果顯示:Tipα可以促進β-catenin C-端Ser675和Ser552的磷酸化，且磷酸化作用具有時間依賴性(6 h最明顯)(圖1A)。用Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939預(yù)處理細胞，再用Tipα刺激，結(jié)果顯示XAV939可以抑制Tipα誘導(dǎo)的β-catenin Ser675和Ser552的磷酸化(圖1B)。

圖1 Tipα對β-catenin Ser675和Ser552磷酸化的影響A:β-catenin在不同時間點的磷酸化(Ser675 and Ser552)水平；B:抑制劑XAV939對β-catenin磷酸化(Ser675 and Ser552)水平的影響

2.2 Tipα對SGC7901細胞β-catenin核轉(zhuǎn)位的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，未用Tipα刺激時，β-catenin主要定位于SGC7901細胞質(zhì)，細胞為橢圓或圓形，而用Tipα刺激細胞12 h后，β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)位，且細胞變?yōu)殚L梭形；當加入Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939后，核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象受到抑制(圖2)。

圖2 Tipα對SGC7901細胞β-catenin核轉(zhuǎn)位的影響

2.3 Tipα對SGC7901細胞EMT標志物表達的影響

用Tipα刺激SGC7901細胞12 h，qRT-PCR和Western blot分別檢測EMT標志物的mRNA和蛋白表達。結(jié)果顯示:上皮標志物(E-cadherin、ZO-1)的mRNA和蛋白表達均降低(P<0.01)，而間質(zhì)標志物(N-cadherin、Vimentin)的mRNA和蛋白表達均升高(P<0.01)，XAV939預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)Tipα誘導(dǎo)的這種表達變化(圖3)。

圖3 Tipα對SGC7901細胞EMT標志物表達的影響A:Tipα對EMT標志物mRNA表達的影響,與PBS組比較，*P<0.01；B:Tipα對EMT標志物蛋白表達的影響

2.4 Tipα對SGC7901細胞c-myc和cyclinD1表達的影響

用Tipα刺激SGC7901細胞12 h，qRT-PCR和Western blot分別檢測Wnt/β-catenin通路下游靶基因c-myc和cyclinD1的mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果顯示:Tipα可以促進c-myc和cyclinD1的mRNA和蛋白表達(P<0.05)，而用抑制劑XAV939預(yù)處理之后，c-myc和cyclinD1的表達受到抑制(圖4)。

圖4 Tipα對SGC7901細胞c-myc和cyclinD1表達的影響A:Tipα對c-myc和cyclinD1 mRNA表達的影響，與PBS組相比，*P<0.05；B:Tipα對c-myc和cyclinD1蛋白表達的影響

圖5 Tipα對SGC7901細胞遷移能力的影響A：劃痕實驗檢測SGC7901細胞的遷移能力；B：Transwell實驗檢測SGC7901細胞的遷移能力與PBS組比較，*P<0.05,**P<0.01

2.5 Tipα對SGC7901細胞遷移能力的影響

使用Tipα處理細胞，于劃痕實驗48 h后進行拍照，比較細胞遷移能力的變化。結(jié)果表明:與對照組相比，Tipα可使SGC7901遷移能力提高(P<0.05)，而用XAV939預(yù)處理后Tipα誘導(dǎo)的細胞遷移能力受到抑制(圖5)。Transwell實驗結(jié)果與劃痕試驗結(jié)果一致(P<0.01)。

3 討 論

H.pylori被國際癌癥研究機構(gòu)于1994年列為Ⅰ類致癌原，其可充當胃癌發(fā)生的“啟動子”的作用[6]。Tipα是H.pylori分泌的新型致癌因子[1]，其可通過激活NF-κB來誘導(dǎo)TNF-α表達，而TNF-α是“炎-癌”轉(zhuǎn)變過程中的重要調(diào)節(jié)因子[7]。此外，Tipα能夠誘導(dǎo)胃上皮細胞發(fā)生EMT從而促進腫瘤進展[3]。在本研究摸索出的最佳濃度和時間(100 μg/mL、12 h)基礎(chǔ)上，用Tipα處理SGC7901細胞，發(fā)現(xiàn)Tipα能夠誘導(dǎo)SGC7901細胞上皮表型分子E-cadherin和ZO-1表達水平降低，而間質(zhì)表型分子N-cadherin和Vimentin表達水平升高，證實了Tipα能夠誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生EMT。

研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路與腫瘤轉(zhuǎn)移早期的EMT現(xiàn)象密切相關(guān)[8]。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路由胞外的Wnt蛋白、膜受體Frizzled、胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin以及下游的靶基因組成[9-10]。當缺乏Wnt信號時，胞質(zhì)中的β-catenin主要是與E-cadherin、α-catenin等結(jié)合形成E-cadherin/catenin復(fù)合體并錨定在細胞骨架上，調(diào)控細胞的黏附與穩(wěn)定，少部分游離的β-catenin則被磷酸化，進而降解；當信號被激活時，β-catenin轉(zhuǎn)位到細胞核，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子T細胞因子/淋巴增強因子(T cell factor/lymphocyte enhancer factor,TCF/LEF)相結(jié)合，啟動下游靶基因c-myc、cyclinD1和Snail等的轉(zhuǎn)錄。c-myc和cyclinD1等原癌基因被激活后可轉(zhuǎn)化為癌基因，刺激細胞增殖，引起腫瘤發(fā)生；Snail等轉(zhuǎn)錄因子可以通過轉(zhuǎn)錄抑制E-cadherin的表達，上調(diào)間質(zhì)標志分子表達，啟動EMT過程[10]。此外，c-myc基因過表達可以下調(diào)E-cadherin的表達，上調(diào)N-cadherin的表達[11]。

本文研究結(jié)果顯示Tipα可以使β-catenin Ser675和Ser552發(fā)生磷酸化，且呈時間依賴性。β-catenin C-端Ser675和Ser552磷酸化能夠促進其核內(nèi)的聚集和轉(zhuǎn)錄活性。同時，Tipα刺激SGC7901之后β-catenin發(fā)生了核轉(zhuǎn)位，Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因c-myc和cyclinD1表達上調(diào)；而用該信號通路抑制劑XAV939預(yù)處理細胞后，上述磷酸化、核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象及靶基因的表達均受到抑制，表明Tipα可以激活Wnt/β-catenin信號通路。XAV939預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)Tipα誘導(dǎo)的上皮標志物(E-cadherin、ZO-1)和間質(zhì)標志物(N-cadherin、Vimentin)表達變化，并抑制Tipα的促細胞遷移能力。本文研究結(jié)果證實了Wnt/β-catenin信號通路參與了Tipα誘導(dǎo)的胃癌細胞EMT形成。

Tipα能夠誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生，而TNF-α能夠上調(diào)人胃癌細胞Wnt/β-catenin通路中促癌基因WNT10B的表達，從而促進胃癌的發(fā)生[12]。此外，巨噬細胞源性的TNF-α能夠激活Wnt/β-catenin信號通路從而促進小鼠胃黏膜腫瘤的發(fā)生[13]。最新研究也表明，Wnt/β-catenin通路是TNF-α的下游靶點，TNF-α可通過該信號通路促進肝癌細胞的EMT[14]。Tipα是通過直接或間接機制激活Wnt/β-catenin信號通路尚待進一步研究。

H.pylori及其毒力蛋白體外細胞共培養(yǎng)模型研究中，常用人AGS、MKN-45、SGC7901、KATO III等胃癌細胞系[15-16]。SGC7901來源于胃腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶,屬于低分化細胞系，為了讓實驗結(jié)果更具有代表性和科學性，本課題組成員擬進一步使用H.pylori Tipα刺激其它胃癌細胞系，觀察Wnt/β-catenin通路激活情況。

綜上，Wnt/β-catenin信號通路參與了Tipα誘導(dǎo)的胃癌細胞EMT的形成，阻斷該信號通路有可能成為胃癌治療的策略之一。本研究為進一步闡明Tipα的致癌機制提供了實驗依據(jù)，同時也為H.pylori相關(guān)性疾病的防治提供了新的方向。