韓鮮艷，張 芾，孫貴祥

(如皋市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南通 226500)

腦出血是腦卒中最嚴(yán)重的一種亞型，具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康，給家庭和社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]，目前還沒有好的方法可以提高腦出血患者的生存率并改善其生活質(zhì)量。甘氨酸作為一種非必需氨基酸在細(xì)胞代謝過程中發(fā)揮著非常重要的作用。

甘氨酸是一種神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑，通過與甘氨酸受體的結(jié)合抑制突觸后神經(jīng)元的活動(dòng)。有研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸在缺血再灌注、缺氧、低氧以及活性氧造成的腦組織神經(jīng)損傷的疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用[2-4]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討甘氨酸對(duì)腦出血造成的神經(jīng)損傷的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甘氨酸(美國(guó)sigma公司)，磷酸酶與張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homologous gene，PTEN)多克隆抗體(美國(guó)Millipore公司)，蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)多克隆抗體(美國(guó)Millipore公司),β-actin抗體(美國(guó)Millipore公司),羊抗鼠/兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，伊文思藍(lán)染液(美國(guó)Invitrogen公司)，RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Illumina公司)。超聲破碎儀(上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)，立體定定位儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)，PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，280～300 g，48只，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，保持室溫在(25±2) ℃，相對(duì)濕度(55±10)%，12 h的晝/夜循環(huán)，大鼠可以自由的攝入食物和水。側(cè)腦室注射自體血建立大鼠腦出血模型并稱取體質(zhì)量編號(hào)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、甘氨酸0.5 mg/kg組和甘氨酸2 mg/kg組，每組各12只。

1.3 方法

1.3.1 腦出血模型的制備 按照Rosenberg法進(jìn)行大鼠腦出血模型的建立[5]：用10%的水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，將大鼠固定在立體儀上，局部消毒后，于頭部正中縱向切口，使骨膜剝離，于前囪之前2.0 mm、中線右側(cè)3.0 mm處鉆孔(1 mm)，用微量進(jìn)樣器取大鼠股動(dòng)脈血適量，借助立體定位儀從鉆孔處垂直進(jìn)針與右側(cè)尾狀殼核處，注入80 μL血液，留針10 min后撤針，縫合，消毒。假手術(shù)組步驟同上，但是不注入血液。

術(shù)后清醒的大鼠按照Zeal Longar 5級(jí)評(píng)分法判斷腦出血模型的建立是否成功。0分：無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1分：不能完全伸展左前肢；2分：向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：不能自行行走，有意識(shí)障礙。累計(jì)1分以上即判定為造模成功。造模第二天，甘氨酸0.5 mg/kg組和甘氨酸2 mg/kg組側(cè)腦室注射甘氨酸，給藥劑量分別為0.5 mg/kg和2 mg/kg[6-7]，假手術(shù)組和模型組側(cè)腦室給等量的生理鹽水,給藥后48 h處死。

1.3.2 腦組織含水量的測(cè)定 每組隨機(jī)取4只大鼠，麻醉后斷頭處死，取大鼠的腦組織，稱重，記為濕重。然后將大鼠的腦組織置于100 ℃的烘箱中72 h，再稱重，記為干重。腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.3 血腦屏障通透性檢測(cè) 每組隨機(jī)取4只大鼠，尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)染液(evans blue dye，EB，5 mL/kg),2 h后水合氯醛麻醉，左心室灌流。取大鼠的腦組織，稱重，加入適量的甲酰胺，60 ℃水浴24 h，勻漿后1 000 r/min離心10 min，取上清液，635 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，計(jì)算EB含量。

1.3.4 血腫塊體積檢測(cè) 取剩余4只大鼠腦組織，準(zhǔn)備好連續(xù)的血腫塊冠狀切片后，拍照，然后用Image J軟件測(cè)量血腫塊體積。

1.3.5 TUNEL染色法檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡的情況 取實(shí)驗(yàn)2.2.4中大鼠腦組織，將大鼠腦血腫組織做成石蠟切片，過氧化氫(3%)室溫孵育5 min，檸檬酸鹽(0.01 mol/L)100 ℃修復(fù)10 min，BSA(5%)室溫封閉1 h，TUNEL(1∶500)室溫孵育90 min,熒光素抗體(1∶500)37 ℃孵育60 min，Hoechst室溫孵育5 min，封片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 Real-timePCR檢測(cè)大鼠腦組織Akt mRNA和PTEN mRNA的表達(dá) 取適量大鼠腦組織，液氮研磨后加入適量的Trizol提取RNA，根據(jù)Prime Script RT試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒說明書進(jìn)行PCR操作。采用相對(duì)定量的方法計(jì)算樣本間的相對(duì)百分比?！鳌鰿t=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照。目的mRNA的量=2-ΔΔCt。

表1 引物序列

1.3.7 Western blot檢測(cè)PTEN蛋白和Akt蛋白的表達(dá)水平 取適量大腦組織加入適量的含PMSF的RIPA裂解液，用超生破碎儀裂解，4 ℃離心(12000 g,10 min)，取上清液，用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，然后加入適量的上樣緩沖液，沸水浴變性。將各組蛋白加入到12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電泳完畢后轉(zhuǎn)膜，PVDF膜用1∶1 000的PTEN、Akt和β-actin抗體進(jìn)行孵育。二抗的稀釋比例為1∶4 000，然后用凝膠成像分析儀顯影，用ImageJ進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦組織含水量、EB含量、腦腫塊體積

4組大鼠腦組織含水量、EB含量比較見表2。與假手術(shù)組比較，模型組腦組織含水量、EB含量升高。與模型組比較，甘氨酸2 mg/kg組腦組織含水量、EB含量顯著性降低。與甘氨酸0.5 mg/kg組比較，甘氨酸2 mg/kg組腦組織含水量、EB含量顯著降低。與假手術(shù)組比較，模型組腦腫塊體積明顯增大，與模型組比較，給予腦甘氨酸干預(yù)后顯著性降低，其中甘氨酸2 mg/kg組腦腫塊體積降低顯著。

表2 各組大鼠腦組織含水量、EB含量及腦腫塊體積的比較

2.2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著升高；與模型組比較，給予甘氨酸后，凋亡細(xì)胞的數(shù)量降低，而且隨著給藥劑量的增加，凋亡細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步降低，見圖1。

圖1 甘氨酸對(duì)ICH后腦組織細(xì)胞凋亡的影響(200×)A：假手術(shù)組；B：模型組；C：甘氨酸0.5 mg/kg組；D：甘氨酸2 mg/kg組

2.3 大鼠腦組織Akt mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平

4組大鼠腦組織Akt mRNA、PTEN mRNA表達(dá)水平比較見表3。與假手術(shù)組比較，模型組Akt mRNA表達(dá)水平降低，PTEN mRNA表達(dá)水平升高。與模型組比較，甘氨酸可升高Akt mRNA表達(dá)水平，降低PTEN mRNA表達(dá)水平，其中2 mg/kg甘氨酸最為顯著。

表3 各組腦組織Akt mRNA、PTEN mRNA的表達(dá)水平比較

2.4 大鼠腦組織Akt蛋白、PTEN蛋白表達(dá)水平

4組腦組織Akt、PTEN蛋白表達(dá)水平比較見圖2和表4。與假手術(shù)組比較，模型組Akt、p-Akt蛋白水平降低,PTEN蛋白水平升高。與模型組比較，甘氨酸可升高Akt、p-Akt蛋白水平,降低PTEN蛋白水平，其中甘氨酸2 mg/kg作用最為顯著。

圖2 各組大鼠腦組織Akt蛋白、PTEN蛋白的表達(dá)A：假手術(shù)組；B：模型組；C：甘氨酸0.5 mg/kg組；D：甘氨酸2 mg/kg組

3 討 論

甘氨酸作為結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的非必需氨基酸，參與機(jī)體很多的病理生理學(xué)過程。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中甘氨酸可以作為神經(jīng)遞質(zhì)參與信號(hào)的傳遞[8]。PTEN/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程中發(fā)揮著非常重要的作用[9]。PTEN是人的第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因，主要的作用底物是PIP3，使其脫磷酸變成PIP2，從而抑制Akt的激活，抑制細(xì)胞的分裂，最終造成細(xì)胞凋亡[10]。而PTEN的突變或者缺失會(huì)造成Akt的激活，活化的Akt可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使蛋白質(zhì)的表達(dá)水平升高從而促進(jìn)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)化、遷移以及代謝[11]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組PTEN蛋白及mRNA的表達(dá)顯著性升高，而Akt蛋白及mRNA的表達(dá)顯著性的降低，給予甘氨酸干預(yù)后，PTEN蛋白和mRNA的表達(dá)水平降低，Akt蛋白和mRNA的表達(dá)升高。此外，模型組腦組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著升高，給予甘氨酸干預(yù)后凋亡細(xì)胞的數(shù)量降低，這可能是由于甘氨酸通過下調(diào)PTEN基因的表達(dá)，使Akt活性增強(qiáng)，間接抑制下游凋亡基因的表達(dá)，從而使神經(jīng)細(xì)胞的凋亡受到抑制，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)組織的作用。有研究也發(fā)現(xiàn)，在缺氧缺糖造成的大鼠神經(jīng)損傷的模型中，甘氨酸可以通過抑制PTEN的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用[12]。

腦出血不僅通過直接的機(jī)械作用導(dǎo)致原發(fā)性腦損傷，也會(huì)引起繼發(fā)性的腦損傷例如血腦屏障通透性的破壞。血腦屏障的破壞引發(fā)腦水腫，進(jìn)而引起神經(jīng)組織的損傷以及細(xì)胞凋亡，加重細(xì)胞功能障礙和壞死[13]。腦水腫使腦組織液體增多致使腦容積變大，根據(jù)血腦屏障是否受到破壞，可以將腦水腫分為血管源型水腫以及細(xì)胞毒性水腫。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦組織血腦屏障通透性降低，腦水腫情況加劇，甘氨酸干預(yù)后，大鼠腦組織血腦屏障通透性升高而且腦水腫減輕，由此可見，甘氨酸具有較好的保護(hù)腦組織的作用。

綜上所述，甘氨酸能夠通過抑制PTEN的表達(dá)從而導(dǎo)致Akt的激活，進(jìn)一步抑制下游凋亡基因的表達(dá)，從而減輕腦細(xì)胞凋亡、降低血腦屏障通透性、減輕腦水腫，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。