張笑天，張莉莉，孫蘇安

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院病理科，江蘇 淮安 223300)

垂體腺瘤多見于30～60歲女性，約占顱內(nèi)腫瘤的22.5%，僅次于腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤和腦膜瘤。其因?yàn)橛绊憙?nèi)分泌系統(tǒng)，常引起全身代謝紊亂。同時(shí)，腫瘤浸潤、破壞、壓迫顱內(nèi)腔，可導(dǎo)致嚴(yán)重功能障礙[1]。近年來，越來越多的研究表明，微小RNA(miRNA)靶向調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)在控制腫瘤細(xì)胞增殖中起重要作用[2-4]。研究表明，miR-34a通過靶向調(diào)控血小板生長因子-β受體、MET原癌基因、TGF-β2受體，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[5-6]。Y性別決定區(qū)基因7(sex determining region Y-box 7,SOX7)在腫瘤的發(fā)生及抑制中發(fā)揮重要作用[7-8]。本研究主要探討miR-34a及SOX7在垂體腺瘤細(xì)胞增殖方面的作用及上下游關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠垂體瘤GH3細(xì)胞株(通派生物科技有限公司)；馬血清、胎牛血清、F12K無血清培養(yǎng)基(Gibco公司)；MTT細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、碘化丙啶(PI)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體、Trizol試劑盒、PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；miR-34a mimics、NC-miR-34a、NC-SOX7、siRNA-SOX7(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；兔抗鼠SOX7多克隆抗體(Abcam)；兔抗鼠GAPDH單克隆抗體(Abcam)；山羊抗兔二抗(Proteintech)；引物序列(日本TaKaRa公司)；迷你雙垂直電泳儀、迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific MultiSkan Go)；TS100倒置熒光顯微鏡(Nikon公司)；PCR儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)。

表1 各引物序列

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CH3細(xì)胞株在含有15%馬血清和2.5%胎牛血清的82.5%F12K培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境控制在37 ℃，5%CO2，100%濕度。每2～3天更換1次培養(yǎng)液,5～6天傳代1次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

按照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，當(dāng)GH3細(xì)胞匯合度大約達(dá)到50%時(shí)，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染不含miR-34a的空質(zhì)粒(NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組)、含有miR-34a基因片段的質(zhì)粒(miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組)、不含有SOX7的空質(zhì)粒(NC-SOX7轉(zhuǎn)染組)、SOX7小RNA干擾(siRNA-SOX7組)，另取未轉(zhuǎn)染CH3細(xì)胞作為未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染6 h后，將培養(yǎng)液換成含10%血清的F12K培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力[9]

將GH3細(xì)胞接種于96孔板中，按“1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染”步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將含有基因片段或空載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，48 h后，舍棄培養(yǎng)液，每孔加入20 μL終濃度為0.5 g/L的MTT，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，舍棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO，通過震蕩使紫色結(jié)晶物充分溶解，使用酶標(biāo)儀于560 nm波長處測(cè)OD值。

1.5 Annexin V-PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率[10]

(1)將GH3細(xì)胞接種于6孔板中，按“1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染”步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染;(2)48 h后，用無EDTA胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，1 000 g離心3 min，吸出上清液;(3)再加入1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，離心，吸出上清;(4)加入195 μL結(jié)合液，重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后，再加入10 μL PI染液，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min;(5)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

(1)將GH3細(xì)胞接種于6孔板中，按“1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染”步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。(2)48 h后，用無EDTA胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞收集到離心管中，1 000 g離心3 min，吸出上清液。(3)再加入1 mL預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，離心，吸出上清。(4)加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇，混勻，4 ℃固定2 h，離心，吸出上清液。(5)再加入1 mL預(yù)冷的PBS，混勻，離心，吸出上清。(6)每管細(xì)胞樣品加入0.5 mL PI染色液，充分重懸混勻細(xì)胞沉淀，37 ℃避光孵育30 min。(7)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)分析。

1.7 熒光定量PCR檢測(cè)miR-34a mRNA及SOX7 mRNA含量

采用TRIzol試劑法提取各組細(xì)胞中的總RNA，隨后采用相關(guān)試劑盒對(duì)樣品RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如表一所示。擴(kuò)增條件是：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火32 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)50個(gè)循環(huán)反應(yīng)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量?！鳌鰿t計(jì)算公式：△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。

1.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中SOX7蛋白表達(dá)

Western blot主要步驟為：將各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，低溫離心，取上清液采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量；配制SDS-PAGE凝膠，上樣后，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；在4 ℃條件下兔抗鼠SOX7多克隆抗體(1∶1 000)，過夜；在室溫條件下孵育山羊抗兔二抗(1∶4 000)；使用ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)成像，并用Image J進(jìn)行半定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果

與未轉(zhuǎn)染組或NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組比較，miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD值顯著降低;與NC-SOX7轉(zhuǎn)染組比較，siRNA-SOX7組細(xì)胞OD值顯著降低，上述結(jié)果表明上調(diào)miR-34a或下調(diào)SOX7表達(dá)均可降低垂體腺瘤細(xì)胞活力(表2)。

表2 各組細(xì)胞活性比較

2.2 細(xì)胞凋亡率

采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，與NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組比較，miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率增加，與NC-SOX7轉(zhuǎn)染組比較，siRNA-SOX7組細(xì)胞凋亡率增加。上述結(jié)果表明上調(diào)miR-34a或下調(diào)SOX7表達(dá)均可增加垂體腺瘤細(xì)胞凋亡率(圖1，表3)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-PI染色A：未轉(zhuǎn)染組；B：NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組；C：miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組；D：NC-SOX7轉(zhuǎn)染組；E：siRNA-SOX7組

2.3 細(xì)胞周期分布

采用流式細(xì)胞術(shù)PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，與NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組比較，miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞G1期延長，S、G2期縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與NC-SOX7轉(zhuǎn)染組比較，siRNA-SOX7組細(xì)胞G1期延長，S、G2期縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明上調(diào)miR-34a或下調(diào)SOX7表達(dá)均可延長垂體腺瘤細(xì)胞G1期，縮短S期和G2期(表4)。

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較 (%)

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期結(jié)果 (%)

2.4 miR-34a mRNA及SOX7 mRNA含量

如表5所示，與NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組比較，miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-34a mRNA含量增多，SOX7 mRNA含量減少。與NC-SOX7轉(zhuǎn)染組比較，siRNA-SOX7組細(xì)胞中SOX7 mRNA含量減少。上述結(jié)果表明，上調(diào)miR-34a表達(dá)可抑制垂體腺瘤細(xì)胞SOX7 mRNA表達(dá)。

表5 PCR檢測(cè)miR-34a及SOX7相對(duì)mRNA含量

2.5 細(xì)胞中SOX7蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)SOX7蛋白表達(dá)見圖2，其相對(duì)表達(dá)量見表6，與NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組相比，miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中SOX7蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低。與NC-SOX7轉(zhuǎn)染組比較，siRNA-SOX7組細(xì)胞中SOX7蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低。上述結(jié)果表明上調(diào)miR-34a表達(dá)可抑制垂體腺瘤細(xì)胞SOX7蛋白表達(dá)。

圖2 各組細(xì)胞SOX7蛋白A：未轉(zhuǎn)染組；B：NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組；C：miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組；D：NC-SOX7轉(zhuǎn)染組；E：siRNA-SOX7組

表6 SOX7蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

miRNA參與多種生物學(xué)過程，例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化和腫瘤增殖。相關(guān)研究[10]表明，miR-34a可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。研究表明，在乳腺癌和肺癌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)異常[11-12]。迄今為止，關(guān)于miR-34a對(duì)于垂體腺瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用及作用機(jī)制的研究較少。SOX7的表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在前列腺癌及乳腺癌中SOX7mRNA表達(dá)水平降低[13-14]；但在胰腺癌中SOX7mRNA表達(dá)水平升高[15]。上述結(jié)果表明：SOX7在不同的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)具有差異性。因此，本研究主要就miR-34a及SOX7在垂體腺瘤細(xì)胞增殖方面的作用及上下游關(guān)系進(jìn)行一系列的研究。

本研究將miR-34a mimics及siRNA-SOX7轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，細(xì)胞經(jīng)MTT染色后，miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組和siRNA-SOX7組細(xì)胞活力OD值分別低于NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組和NC-SOX7轉(zhuǎn)染組，該結(jié)果提示上調(diào)miR-34a或下調(diào)SOX7表達(dá)均可降低垂體腺瘤細(xì)胞活力。通過Annexin V-PI染色分析上調(diào)miR-34a或下調(diào)SOX7表達(dá)對(duì)垂體腺瘤細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組和siRNA-SOX7組細(xì)胞凋亡率分別高于NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組和NC-SOX7轉(zhuǎn)染組，該結(jié)果表明上調(diào)miR-34a或下調(diào)SOX7表達(dá)均可增加垂體腺瘤細(xì)胞凋亡率。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組和siRNA-SOX7組S期、G2期分別低于NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組和NC-SOX7轉(zhuǎn)染組，G1期分別高于NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組和NC-SOX7轉(zhuǎn)染組，上述結(jié)果表明上調(diào)miR-34a或下調(diào)SOX7表達(dá)均可延長垂體腺瘤細(xì)胞G1期，縮短S期和G2期，進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂增殖。

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法分別檢測(cè)上調(diào)miR-34a表達(dá)或下調(diào)SOX7表達(dá)對(duì)垂體腺瘤細(xì)胞SOX7基因及蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示miR-34a mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中SOX7 mRNA相對(duì)表達(dá)量和SOX7蛋白水平均低于NC-miR-34a轉(zhuǎn)染組，該結(jié)果與siRNA-SOX7組結(jié)果一致，上述結(jié)果提示上調(diào)miR-34a表達(dá)可抑制SOX7表達(dá)，從而發(fā)揮其抑制垂體腺瘤細(xì)胞增殖的作用。既往研究[6]結(jié)果顯示miR-34a可靶向TGF-β2受體抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但在本研究中miR-34a是否通過靶向TGF-β2受體下調(diào)SOX7表達(dá)，亦或通過下調(diào)SOX7表達(dá)靶向TGF-β2受體抑制垂體腺瘤細(xì)胞增殖仍有待開展試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-34a mimics能夠通過靶向負(fù)調(diào)控SOX7表達(dá)，誘導(dǎo)垂體腺瘤GH3細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G1期。其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。