張 皓，周穎禎

(蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 蘇州 215101)

腦出血(cerebral hemorrhage,CH)發(fā)病率每年為萬(wàn)分之一到萬(wàn)分之三，死亡率為30%～50%[1-2]。CH多見(jiàn)于腦組織持續(xù)性出血、血腫擴(kuò)大、血腫周?chē)毖獛?、腦水腫、炎癥反應(yīng)等，其中腦水腫和炎癥反應(yīng)是最嚴(yán)重的致病因素[3-4]。腦水腫具有神經(jīng)毒性，可降低腦神經(jīng)功能，造成神經(jīng)功能障礙[5]。炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是腦水腫繼發(fā)性損傷的主要原因。目前臨床上以脫水降低顱內(nèi)壓、控制血壓、改善營(yíng)養(yǎng)代謝和防止并發(fā)癥等對(duì)癥及支持療法為主要的治療方案。凝血酶相關(guān)指標(biāo)如蛋白酶激活受體-1(PAR-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)受體是反應(yīng)CH后繼發(fā)性腦損傷的重要指標(biāo)。研究報(bào)道，保護(hù)蛋白Mip-1廣泛分布于腦組織中，與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和腫瘤的轉(zhuǎn)化具有密切關(guān)系[6-7]，但目前對(duì)于Mip-1與CH腦組織損傷嚴(yán)重程度的關(guān)系報(bào)道較少。本研究選取大鼠自體股靜脈建立尾狀核腦出血模型，研究Mip-1、PAR-1、MMP-9等水平與CH嚴(yán)重程度的關(guān)系，旨在為臨床CH的診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只(SPF級(jí))，體質(zhì)量250～280 g，平均(261.3±6.2) g，喂養(yǎng)于23 ℃～25 ℃、相對(duì)濕度45%～60%、光照12 h的環(huán)境中。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、儀器

Ⅳ型膠原酶(sigma公司)，水合氯醛(國(guó)家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司批號(hào)20111024);引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成;SV Total RNA Isolation System(Promega公司);ReverTra-Plus-TM試劑盒(PCR-501)(TOYOBO公司);Go Taq qPCRMasterMix(A6001)(Promega公司);Thermo ScientificRevert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(#K1621)(Thermo公司)；蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，石蠟切片機(jī)(徠克公司SQ2125)，DAB濃縮型試劑盒(上?；鶢栴D生物科技有限公司)，鼠抗人Mip-1多克隆抗體(Santa Cruz生物技術(shù)公司)，羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 分組及造模方法

術(shù)前所有大鼠禁食、禁水，腹腔注射100 g/L(300 mg/kg)水合氯醛進(jìn)行麻醉，對(duì)頭、股部皮膚，消毒備用。于右股處切開(kāi)長(zhǎng)約10～15 mm的切口，分離肌肉和神經(jīng)，暴露出股動(dòng)脈。將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，仰臥位，正中切開(kāi)頭皮，以前囟中央為原點(diǎn)，前后0.2 mm范圍，在正中線右旁3.5 mm處鉆孔至顱骨下硬膜，CH組大鼠將100 μL股動(dòng)脈血用微量注射器垂直進(jìn)針以3～10 μL/min緩慢勻速注入大鼠尾狀核內(nèi)，進(jìn)針深度約5.5 mm，注射完畢，留針5 min，退針。對(duì)照組大鼠只進(jìn)行手術(shù)過(guò)程，不注射股動(dòng)脈血。骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 HE染色 分別于造模后3，12，24，72 h，每組各取9只大鼠，100 g/L(300 mg/kg)水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，開(kāi)胸暴露心臟，從左心室插管至主動(dòng)脈，右心耳處留出開(kāi)口，注射200 mL 37 ℃的生理鹽水，無(wú)血污后，改為注射400 mL的4 ℃的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液。斷頭處死大鼠，冠狀面以血腫為中心，與2 mm半徑范圍取腦組織，將其固定在4%多聚甲醛中浸泡12～24 h，依次經(jīng)過(guò)脫水、石蠟包埋后連續(xù)冠面切取厚度為3 μm的切片，按照HE試劑盒操作步驟進(jìn)行HE染色。

1.4.2 腦組織含水量檢測(cè) 相同操作去除腦組織，去除嗅球及額極前部4 mm的腦組織，以右側(cè)大腦半球中部注射針眼處冠狀位切割腦組織，可見(jiàn)在尾狀核部位有腦血腫，濾紙擦去腦組織表面水分，取血腫側(cè)腦組織置天平內(nèi)稱取濕質(zhì)量，然后置100 ℃電烤箱24 h，再迅速測(cè)干質(zhì)量。計(jì)算腦含水量(%)=[(濕腦質(zhì)量-干腦質(zhì)量)/濕腦質(zhì)量]×100%。

1.4.3 Western blot檢測(cè) 簡(jiǎn)略步驟如下：取少量腦血腫周?chē)M織置于1～2 mL勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊剪碎，加400 μL去污劑裂解液于勻漿器中，并在冰上進(jìn)行勻漿，裂解30 min后，用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，然后在4 ℃條件下，12 000 rpm離心 5 min, 取上清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，隨后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳， 轉(zhuǎn)膜、加(1∶1 000)Mip-1，PAR-1，MMP-9的兔抗鼠多克隆抗體(一抗)封閉，4 ℃條件下過(guò)夜。第二天，室溫放置40 min,PBS洗3次，每次3 min,加二抗(兔抗鼠)，使用凝膠成像系統(tǒng)成像，并用Image J進(jìn)行半定量分析。

1.4.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 神經(jīng)功能評(píng)分采用Garcia等制定的評(píng)分方法，主要包括籠中自發(fā)活動(dòng)、四肢對(duì)稱運(yùn)動(dòng)、前肢對(duì)稱外展、爬鐵籠壁、軀干對(duì)鈍棒觸及反應(yīng)、觸須對(duì)鈍棒觸及反應(yīng)，最高評(píng)分18分、最低評(píng)分3分，分?jǐn)?shù)越低表示，神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦組織形態(tài)學(xué)觀察

圖1A為對(duì)照組各時(shí)間段的代表照片，可見(jiàn)腦組織結(jié)構(gòu)清晰、神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則、未見(jiàn)有細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、核固縮及崩解；圖1B、C、D、E分別為CH組大鼠腦組織HE染色造模后3，12，24，72 h的結(jié)果，可見(jiàn)出現(xiàn)明顯的核固縮、細(xì)胞溶解、神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、神經(jīng)細(xì)胞周?chē)淮罅康难仔约?xì)胞浸潤(rùn)，在造模后72h可見(jiàn)腦組織中大量的液化壞死區(qū)域。

圖1 腦組織形態(tài)學(xué)(HE 400×)A：對(duì)照組；B、C、D、E：CH組大鼠造模后3，12，24，72 h

2.2 兩組大鼠腦組織的水腫情況

CH組大鼠在造模后3，12，24，72 h的腦組織含水量顯著高于對(duì)照組，且隨著時(shí)間的增加含水量呈上升趨勢(shì)(P<0.05，表1)。

表1 兩組大鼠腦組織的含水量情況 (%)

2.3 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分變化

CH組大鼠在造模后3，12，24，72 h的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著低于對(duì)照組，且隨著時(shí)間的增加呈降低趨勢(shì)，說(shuō)明出血對(duì)神經(jīng)功能有損傷作用(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表2 兩組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分變化 (分)

2.4 大鼠腦血腫周?chē)M織中的Mip-1、PAR-1、MMP-9蛋白表達(dá)變化

CH組大鼠在造模后3，12，24，72 h的Mip-1、PAR-1、MMP-9蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，且隨著時(shí)間的增加呈升高的趨勢(shì)(P<0.05，表3，圖2、圖3和圖4)。

表3 兩組大鼠腦血腫周?chē)M織中的各蛋白表達(dá)變化(相對(duì)表達(dá)量)

圖2 兩組大鼠腦血腫周?chē)M織中的Mip-1蛋白表達(dá)1：3 h；2：12 h；3：24 h；4：72 h

圖3 兩組大鼠腦血腫周?chē)M織中的PAR-1蛋白表達(dá)1：3 h；2：12 h；3：24 h；4：72 h

圖4 兩組大鼠腦血腫周?chē)M織中的MMP-9蛋白表達(dá)1：3 h；2：12 h；3：24 h；4：72 h

3 討 論

將大鼠自體股動(dòng)脈血注入至尾狀核中創(chuàng)建高血壓腦出血模型，該種建模方法較其它建模方法更接近于臨床高血壓出血，且建模成功率達(dá)97.5%[8-9]。本研究結(jié)果顯示，急性腦出血大鼠腦水腫隨著出血時(shí)間逐步增加，出血后第三天達(dá)到水腫最高峰，與國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]。腦出血發(fā)生后腦部水含量上升的原因主要與腦出血病理生理性改變相關(guān)，腦組織血管受血腫壓迫，腦循環(huán)障礙，血腦屏障破壞，且血腫分解后產(chǎn)生釋放多種活性物質(zhì)，是導(dǎo)致腦出血后相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的主要原因。主要表現(xiàn)為，神經(jīng)細(xì)胞壞死凋亡、神經(jīng)組織中炎癥因子浸潤(rùn)、血腦屏障破壞等一系列較嚴(yán)重的繼發(fā)性腦損傷。腦出血后血管超微結(jié)構(gòu)也嚴(yán)重受損[11]。血腫以絕對(duì)水腫體積大于相對(duì)水腫體積為主要特點(diǎn)。其原因主要是，血腫中包含的凝血酶、炎癥介質(zhì)等活性物質(zhì)通過(guò)劑量效應(yīng)加重血腫周?chē)[程度。有研究報(bào)道，腦出血在腦組織的不同損傷區(qū)域及損傷面積大小與不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，急性腦出血大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分逐漸降低，且與腦水腫趨勢(shì)相同，與以往研究報(bào)道結(jié)果一致。

Mip-1是參與腦出血損傷保護(hù)機(jī)制中的具有多種生物學(xué)功能的核轉(zhuǎn)錄因子。有研究顯示，大鼠短暫性非損傷性出血Mip-1水平升高[13]。本研究結(jié)果顯示,與健康組比較，CH組大鼠Mip-1水平顯著升高。推測(cè)Mip-1參與了減輕腦出血后的腦水腫，起到保護(hù)腦組織作用。生理?xiàng)l件下，大腦皮層扣帶回、皮質(zhì)、下丘腦核團(tuán)、丘腦腹側(cè)、中腦、海馬和小腦的神經(jīng)元，均有PAR-1的表達(dá)。凝血酶作為內(nèi)源性凝血和外源性凝血的共同作用通路，在維持血管內(nèi)凝血機(jī)制中具有重要作用。研究報(bào)道大腦基底節(jié)出血周邊組織中存在凝血酶表達(dá)異常升高，其受體PAR-1水平也相應(yīng)升高[14]。有學(xué)者加入凝血酶抑制劑后，減輕凝血酶對(duì)出血性大腦的損傷。其機(jī)制可能是，凝血酶與受體親和力降低后，可減弱細(xì)胞內(nèi)三磷酸尿苷和酪氨酸激酶的活性，下調(diào)Xa因子(其參與蛋白裂解方式產(chǎn)生凝血酶的重要途徑)，進(jìn)而減輕凝血酶對(duì)出血性大腦的損傷程度。鄒有瑞等[15]通過(guò)研究心源性梗死患者M(jìn)MP-9表達(dá)水平，結(jié)果表明MMP-9異常升高可預(yù)測(cè)NIHSS和梗死灶體積。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦出血患者周邊組織中MMP-9含量異常升高，可作為評(píng)估出血程度和疾病轉(zhuǎn)歸的評(píng)估指標(biāo)。

綜上所述，CH大鼠腦血腫周?chē)M織中的Mip-1、PAR-1、MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)，可能與腦組織水腫、神經(jīng)功能缺損加重有關(guān)。