李兆華

（吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130033）

人工授精在豬的繁殖培育中應(yīng)用已比較普遍。如何在生豬產(chǎn)業(yè)中像養(yǎng)牛生產(chǎn)一樣方便快捷地使用冷凍精液，一直困擾著一線的技術(shù)和生產(chǎn)人員。在借鑒牛凍精生產(chǎn)與應(yīng)用經(jīng)驗基礎(chǔ)上，利用豬冷凍精液進行人工授精并成功產(chǎn)下仔豬后，眾多科研工作者對豬冷凍精液技術(shù)進行了一系列深入的研究。目前，英國、美國、加拿大等一些國家的育種公司已經(jīng)有豬冷凍精液的產(chǎn)品進行出售，但解凍后的精子活率以及配種后的受胎率、產(chǎn)仔數(shù)與常溫保存豬精液的效果還有一定的差距。現(xiàn)在，中國商品化的豬冷凍精液的應(yīng)用效果比國外的要好。近5年來，我國豬冷凍精液技術(shù)的研究取得了長足的進步。豬冷凍精液這個相對的新鮮事物已經(jīng)為業(yè)內(nèi)人士所熟悉。市場前景十分看好，目前，國內(nèi)多家業(yè)內(nèi)知名企業(yè)十分重視豬冷凍精液商業(yè)化的生產(chǎn)和銷售。

文章將從豬冷凍精液的生產(chǎn)制作、解凍與輸精3個方面進行梳理與總結(jié)，希望能加深廣大讀者對豬冷凍精液這個相對新鮮事物的進一步了解。

1 冷凍精液的生產(chǎn)制作

主要包括精液的采集、品質(zhì)鑒定、稀釋、平衡、冷凍、低溫保存幾個步驟。

1.1 精液采集

采集豬精液是制作豬冷凍精液的第一個步驟。方法為手握采精法（如圖1），大型公豬站也可使用自動采精器采精（如圖2）。

建議采精得到全部豬精液再進行后續(xù)的生產(chǎn)操作。因為在實際生產(chǎn)中，采集得到精液后，將精液進行稀釋操作之前必定會有一定的時間間隔，不可能馬上稀釋。若精液不進行及時的稀釋，濃度過高的原精在未經(jīng)過稀釋處理的狀態(tài)下，活力會很快下降，從而影響精液冷凍保存后的質(zhì)量。

1.2 品質(zhì)鑒定

通過外觀檢查和利用顯微鏡對精液的品質(zhì)進行鑒定，確保用于冷凍保存的原精的質(zhì)量符合要求。

1.2.1 外觀檢查

外觀檢查就是感官檢查，通過視覺、嗅覺對精液的外觀、氣味、數(shù)量進行評定。通常精液呈云霧狀的乳白色，顏色深淺與精子的密度有關(guān)，異常顏色有暗紅色、黃、綠等，可能是生殖道出血和感染化膿所致；略帶腥味；1次全精量為200～400 mL左右，射精量極少或極多，均不宜使用。

1.2.2 顯微鏡檢查

就是利用顯微鏡對精子的狀況進行觀察。內(nèi)容包括活率、密度和形態(tài)。

活率一般采用目測法估計，為了能真實反映精子的狀況，需要配備帶有恒溫臺的顯微鏡進行觀察。根據(jù)視野中相對直線運動精子的數(shù)量占總精子數(shù)的比率來評估。通常采用0.0～1.0的形式進行記錄，數(shù)值越高活率越好。也可使用計算機系統(tǒng)進行檢查。

原精的精子密度一般為2億～3億/mL?？墒褂媚繙y法、血細胞計數(shù)法、便攜式精子密度儀和計算機系統(tǒng)來測定精子密度。

目測法可粗略地將精子的密度評定為：密、中、稀。密是指視野中充滿精子，精子間緊密相連；中是指精子間空隙明顯；稀是指精子間空隙間隙超過1個精子以上。如圖3所示。目測法要求技術(shù)人員要有足夠的經(jīng)驗并且主觀性較大，最為方便和快捷，在常溫液態(tài)保存精液的生產(chǎn)中較為常用。但此法不適合冷凍精液的生產(chǎn)，因為只有準(zhǔn)確的密度才能保證生產(chǎn)出的每個劑量的冷凍精液中精子的準(zhǔn)確數(shù)量。

血細胞計數(shù)法可準(zhǔn)確地測定每 ml精液中的精子數(shù)量。將精液滴到蓋玻片旁，如圖4和圖5，利用虹吸作用使精液均勻分布在蓋玻片和血細胞計數(shù)板之間，在放大400～600倍的條件下觀察并計數(shù)。血細胞計數(shù)板上刻有25個大方格，隨機計算5個大方格中精子的總數(shù)，然后推算精子密度。計算公式為：精子密度=5個中方格總精子數(shù)×5×10×1 000×稀釋倍數(shù)，如圖6。此法最為準(zhǔn)確，但也最費時費力。

便攜式精子密度儀和計算機系統(tǒng)可以快速準(zhǔn)確的測定出精子的密度。但是需要一定的投資，并且在使用過程中也需要利用血細胞計數(shù)法進行校對。如圖7、圖8。

精子正常的形態(tài)，是精子生物學(xué)功能的前提保障。形態(tài)檢查通常將精子畸形率以及頂體異常率作為精子形態(tài)的主要指標(biāo)。兩者都需要先對精子進行染色，然后將載玻片放在400倍的顯微鏡下進行觀察，記錄若干個視野中200個左右的精子中畸形或頂體異常精子占計數(shù)總精子的百分比。

精子畸形主要發(fā)生在精子頭部、頸部和尾部，表現(xiàn)為頭部缺損、巨頭、微頭、雙頭、無頭、雙尾、無尾、頸部彎曲等。豬精液中精子畸形率應(yīng)小于18%。精子頂體異常表現(xiàn)為頂體的膨脹、缺損和脫落，在正常豬精液中，精子頂體異常率不超過2%。若兩者的數(shù)值過高則表示精液品質(zhì)較差不適合用于輸精，更不適合用于冷凍精液的生產(chǎn)制作。研究證明頂體完整率和不返情率之間比精子活率與不返情率之間相關(guān)性更重要。

1.3 原精稀釋與平衡

稀釋液配方是影響豬精液冷凍效果最主要的因素，之所以近5年來國內(nèi)在豬精液冷凍技術(shù)上取得了很大的進步，主要就是因為配方的改進比較成功。配方成分按照功能劃分主要有營養(yǎng)物質(zhì)、緩沖劑、抗氧化劑、抗凍劑和其他添加劑。營養(yǎng)物質(zhì)包括葡萄糖、BSA等；緩沖劑包括磷酸鹽、EDTA、檸檬酸鈉等；抗氧化劑包括維生素E、番茄紅素、褪黑素、谷胱甘肽等；抗凍劑包括甘油、乙酰胺、核糖醇、卵黃、木糖醇和二甲基亞砜等；添加劑包括咖啡因、生殖激素、乙酮可可堿、細胞因子、氨基多糖、抗生素等。

稀釋與平衡相輔相成或者說是交替進行的。稀釋倍數(shù)要根據(jù)原精液的活率、密度以及每個冷凍劑量（每個細管）中含有的有效精子數(shù)而定?，F(xiàn)以一種公開的稀釋平衡程序為例進行說明：采集到的新鮮精液應(yīng)盡快在等溫條件下進行第一次稀釋（2～4倍），25 ℃條件下平衡1 h，然后17 ℃條件下平衡2 h，800 g、17 ℃條件下離心，再用稀釋液等溫重懸浮后，4 ℃條件下平衡3 h，再加入含有甘油的稀釋液，灌裝。

1.4 冷凍和保存

豬精液冷凍的形式主要包括細管、顆粒、袋裝和安瓿四種。細管形式是將平衡后的精液吸入聚氯乙烯細管中，冷凍后，再浸入液氮中保存。目前絕大多數(shù)的豬冷凍精液都用這種形式。其特點是不易受污染，冷凍效果好，體積小，便于貯存運輸和機械化生產(chǎn)。

豬精液可以使用干冰、液態(tài)氮、液態(tài)氦作為冷源進行冷凍。現(xiàn)在不論是熏蒸法還是程序冷凍儀都以液氮為冷源。其主要操作方法為在距離液氮面一定的高度熏蒸一定的時間，也可使用程序冷凍儀。然后放入液氮中保存。保存期間要注意液氮罐中的液氮量，原則上細管要浸泡在液氮中。

2 解凍

冷凍精液使用水浴解凍，溫度通常為0～5 ℃、30～40 ℃和50～70 ℃三個范圍，其中利用熱水解凍，是目前最常用的方法。從液氮中取出的細管，快速地放入到水浴鍋或水浴杯中進行解凍。解凍時間隨溫度的提高而減少，具體情況要根據(jù)產(chǎn)品的說明來進行。解凍后細管里的精液要用解凍液進行稀釋。稀釋液要預(yù)先加熱到30 ℃左右，然后在顯微鏡下檢查復(fù)蘇后精子的活率。解凍液的配方對于解凍后精子活率有很大的影響。有研究表明加安鈉咖注射液、葡萄糖、檸檬酸鈉混合稀釋液和精清會有較好解凍效果。

3 輸精

輸精是豬冷凍精液實際應(yīng)用的關(guān)鍵所在。通常豬人工授精的輸精方法分為常規(guī)輸精和深部輸精。

常規(guī)輸精也就是子宮頸輸精，如圖9，輸精部位在子宮頸口前端。需有效精子數(shù)30億左右，輸精劑量在80～100 mL，因輸精位置比較靠外，輸精后精液易倒流（輸精后1 h內(nèi)約有30%～40%）。有研究表明，輸入子宮頸的30億精子經(jīng)過重重障礙到達受精部位的精子數(shù)大約只有1 000個。因此，要想獲得理想的受精效果，需要較大的輸精量，包括精液體積和有效精子數(shù)。據(jù)報道，用豬冷凍精液進行子宮頸輸精，即使輸精量比常溫精液多很多，受胎率和產(chǎn)仔數(shù)仍比常溫精液要低。

深部輸精顧名思義比常規(guī)輸精的部位要深。根據(jù)輸精部位的不同可分為子宮體輸精、子宮角輸精和輸卵管輸精。其中輸卵管輸精法需要微創(chuàng)手術(shù)和內(nèi)窺鏡的方法將精液直接輸入母豬子宮和輸卵管的交界部位；子宮角輸精法則需要特制的內(nèi)導(dǎo)管，使輸精部位在子宮角近端的1/3處。這兩種方法因為技術(shù)操作復(fù)雜、耗時費力，成本較高，需要較高的專業(yè)水平和極為熟練的技術(shù)操作，主要應(yīng)用于要求較高的科研試驗。不適合生產(chǎn)實際應(yīng)用。見圖10和11。

使用豬冷凍精液進行配種時，建議采用深部輸精技術(shù)，而且是子宮體輸精法，見圖12。子宮體輸精法常用的輸精管有兩種：管內(nèi)袋式，如美國生產(chǎn)的AMG管。外觀與普通輸精管基本相似，但在輸精管的頂部連接一個可延展的橡膠軟管（置于輸精管內(nèi)部），在輸精初期通過用力擠壓輸精瓶，使橡膠軟管向子宮內(nèi)翻出，穿過子宮頸將精液導(dǎo)入子宮體內(nèi)。另外一種是管內(nèi)管式：在常規(guī)輸精管內(nèi)部加有一支細的、半軟的、長度常規(guī)輸精管約15 cm的內(nèi)導(dǎo)管，能夠在常規(guī)輸精管內(nèi)部延伸以通過子宮頸進入子宮體。見圖13和圖14。有研究表明，采用子宮體輸精法，每次輸精的有效精子數(shù)只有10億也不影響受胎率和產(chǎn)仔數(shù)。

豬冷凍精液是個相對新鮮事物，因為到目前為止，研究豬冷凍精液技術(shù)已經(jīng)有將近60多年的時間。最早在1957年就有應(yīng)用豬冷凍精液配種產(chǎn)出仔豬的報道。但是因為解凍后精液的質(zhì)量與鮮精和常溫保存精液的質(zhì)量相比，仍有較大的差距，造成母豬的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)一直較低，除了在引種和保種等方面有一定的意義，對養(yǎng)豬業(yè)的實際生產(chǎn)中的經(jīng)濟效益并沒有突出的貢獻。但是隨著國內(nèi)近幾年豬精液冷凍液保存技術(shù)的進步，豬冷凍解凍后精液的質(zhì)量相較于常溫保存精液的質(zhì)量沒有很大差距，采用冷凍精液繁育的種豬在受胎率和產(chǎn)仔數(shù)方面均得到了很大地提高，這使得豬冷凍精液真正商業(yè)化應(yīng)用成為可能。