菅芯蕊 ，張志彬 ，王 珺 ，張紹萱 ，于永生 ，羅曉彤 ，李兆華 ＊

（1. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧科學(xué)分院，吉林 公主嶺 136100；2. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 畜牧學(xué)系，吉林 延吉 133002；3. 吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

現(xiàn)階段畜禽生產(chǎn)中，由于冷凍精液具有貯存時間長，可減少動物傳染病傳播，經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，使得冷凍精液技術(shù)得到了快速發(fā)展，但是對于當(dāng)前行業(yè)發(fā)展需求來說，豬冷凍精液的發(fā)展仍有很大的空間。氧化應(yīng)激是影響解凍后豬精液品質(zhì)下降的主要原因。冷凍精液解凍后精液中的氧化應(yīng)激，主要是因?yàn)檫^量的活性氧（ROS）攻擊精子。過量的ROS主要引起精子的脂質(zhì)過氧 化（lipid Peroxidation） 和 DNA片段化[1]。使精子畸形率上升，精子活率、精子運(yùn)動速率等下降，最終導(dǎo)致受胎率、產(chǎn)仔率下降，流產(chǎn)率、胎兒畸形率上升。為了減弱ROS對精子的影響，研究人員嘗試加入抗氧化劑后，發(fā)現(xiàn)具有較好的效果。

X. G. Weng等[2]研究發(fā)現(xiàn)在凍存的公豬精液中添加黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）可以提高精子的抗氧化水平，改善體外受精（in vitro fertilization，IVF）參數(shù)和胚胎發(fā)育的結(jié)果。S. K.Baishya等[3]在冷凍基礎(chǔ)液中補(bǔ)充谷胱甘肽、維生素E和丁基化羥基甲苯，試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)其可以顯著提高精子解凍后的活力，使精子頂體和質(zhì)膜保持完整，脂質(zhì)過氧化的發(fā)生率顯著降低。隨后S. K. Baishya等[4]在另一篇文章中指出，用含膽固醇的甲基-β-環(huán)糊精進(jìn)行預(yù)冷凍處理，也可提高冷凍保存豬精液的質(zhì)量。豬精子由于精子膜中不飽和脂肪酸含量多，對氧化應(yīng)激特別敏感，某些豬精漿抗氧化劑會積極參與公豬精子耐冷耐受性，使低溫處理引起的氧化應(yīng)激最小化。

白 藜 蘆 醇（resveratrol，Res）主要來自葡萄和毛葉藜蘆。它是一種天然抗氧化劑，一種植物防御素，對植物起保護(hù)作用，在植物遇到過量紫外線照射、真菌感染等不適宜條件下產(chǎn)生[5]。Res作為一種天然的非黃酮類多酚物質(zhì)，近年來一直是科學(xué)研究的焦點(diǎn)，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為它對人類健康有積極影響[6]。Res的化學(xué)式為C12H14O3，分子量為 228.25，具有抗氧化、抗癌、降糖和抗衰老的活性[7]。Res的細(xì)胞防御機(jī)制是通過直接中和ROS或間接增強(qiáng)抗氧化酶的表達(dá)來抑制低密度脂蛋白（LDL）氧化維持細(xì)胞氧化還原平衡[8]?？寡趸瘎㏑es對精子發(fā)生有保護(hù)作用[9]。C. R. Lv 等[10]研究表明補(bǔ)充10 μM或50 μM濃度的Res可以改善解凍后山羊精子的質(zhì)量，這可能是抑制ROS的產(chǎn)生所引起的。N. Abouzar等[11]研究表明添加40 μM白藜蘆醇的改良BTS（beltsville thawing solutjon）擴(kuò)展劑可提高雞精子解凍質(zhì)量。說明Res在精液冷凍保存中具有實(shí)用性。為了評價Res對豬凍融精子質(zhì)量的影響，該研究將不同濃度的Res添加到冷凍基礎(chǔ)液中，對凍融精子的質(zhì)量進(jìn)行評價，以期為建立高效豬精液冷凍技術(shù)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮豬精液來源于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院原種豬場的松遼黑豬。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

BTS溶液：二水檸檬酸三鈉1.25 g，乙二胺四乙酸1.25 g，碳酸氫鈉1.25 g，青霉素鈉0.60 g，氯化鉀0.75 g，葡萄糖37.00 g，硫酸鏈霉素1.00 g在1 000 mL三蒸水中溶解， pH調(diào)節(jié)為7.2～ 7.4，滲透壓310 mOsm/L，4 ℃保存。

冷凍基礎(chǔ)液Ⅰ：乳糖35 g，葡萄糖25 g，青霉素鈉0.60 g，碳酸氫鈉1.25 g，硫酸鏈霉素1.00 g，卵黃200 mL溶于800 mL三蒸水中，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4，滲透壓317 mOsm/L，4 ℃保存。

冷凍基礎(chǔ)液Ⅱ：添加OEP和甘油，在冷凍基礎(chǔ)液Ⅰ的基礎(chǔ)上使OEP終濃度為0.50%（v/v），甘油終濃度為3.00%（v/v）。

果糖-檸檬酸鈉低滲溶液：二水檸檬酸鈉7.35 g，果糖13.51 g在1 000 mL三蒸水中溶解，滲透壓150 mOsm/L，4 ℃保存。

吖啶橙（acridine orange，AO）染液：AO 0.010 g，檸檬酸0.764 g，磷酸氫二鈉0.806 g溶于57.500 mL三蒸水中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2’，7’-二 氯 二 氫 熒 光 素二 乙 酸 酯（2’,7’-dichloro dihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）染液：DCFH-DA 0.50 g，用DMSO 102.61 mL溶解，分裝，避免反復(fù)凍存。

1.2.2 采集精液

采用手握采精法，佩戴滅菌手套，右手握公豬陰莖模仿母豬對公豬的刺激以誘導(dǎo)射精，左手拿著采精杯，杯子上覆蓋著精液過濾膜，舍棄開始的稀精部分，收集濃精部分。

1.2.3 精液冷凍

采集的精液用保溫箱裝好，于2 h之內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。首先通過嗅覺和眼觀檢查，選擇帶腥味、乳白色的精液進(jìn)行鏡檢，選擇活力在90%上，密度介于2.0億～4.0 億/mL的精液進(jìn)行凍存前處理。

合格的精液等溫等體積加入BTS溶液稀釋，置于25 ℃恒溫箱1 h，期間不定時混勻精液，然后放入17 ℃恒溫箱平衡2 h，期間不定時混勻。平衡后的精液等體積分為5份，2 400 r/min，17 ℃下離心10 min，棄上清，沉淀備用，冷凍基礎(chǔ)液Ⅰ17 ℃預(yù)冷。然后分別加入沉淀中（0、25 μM、50 μM、100 μM、200 μM的Res分別加入冷凍基礎(chǔ)液Ⅰ中），重懸后4 ℃恒溫箱中平衡3 h。隨后加入等體積的冷凍基礎(chǔ)液Ⅱ，使精子終濃度為5×108個/mL，混勻后灌裝于0.5 mL細(xì)管中，封口。液氮熏蒸（上方3 cm處），熏蒸10 min，然后放入液氮中。在液氮罐中儲存1個月后檢測精液質(zhì)量。

1.2.4 精液解凍

從液氮罐中取出待測樣品，50 ℃水浴鍋中孵育16 s（細(xì)管離開液氮不能超過8 s），轉(zhuǎn)移至37 ℃預(yù)熱的1.5 mL離心管中待檢，精液解凍后進(jìn)行以下檢測。

1） 精子活力檢測

活力通過計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）檢測。

2）精子質(zhì)膜完整性檢測

使用精子低滲透膨脹試驗(yàn)（HOST）來檢驗(yàn)精子的質(zhì)膜完整性。果糖-檸檬酸鈉低滲溶液提前37 ℃預(yù)熱，精液解凍，然后與果糖-檸檬酸鈉低滲溶液混合，溶液的添加量使精液終濃度為5×106個/mL，放在37 ℃水浴鍋中15 min，涂片鏡檢，尾部卷曲的是質(zhì)膜完整的精子，尾部不卷曲的精子是質(zhì)膜受損的精子，本試驗(yàn)每次至少計(jì)數(shù)200個精子，重復(fù)5次以上。

3）精子頂體完整性檢測

使用異硫氰熒光素標(biāo)記的花生凝集素（fl uorescein isothiocyanate peanut agglutinin，F(xiàn)ITC-PNA）熒光染色法檢測。解凍后的精液中加入1 mL于37 ℃預(yù)熱好的PBS，使用控溫離心機(jī)2 400 r/min離心5 min，留下沉淀，在其中加入PBS重懸，反復(fù)3次。最后1次用PBS調(diào)整精液濃度，使精子密度保持在5×106個/mL左右，混勻，取30 μL均勻涂在載玻片上，自然晾干后用甲醇均勻涂片，室溫下固定10 min，然后在黑暗環(huán)境下取30 μL FITC-PNA染液均勻涂在載玻片上，把載玻片放到濕暗盒中，濕暗盒放到37 ℃恒溫箱中，30 min以后取出，PBS緩慢沖洗，黑暗環(huán)境下自然晾干。200×熒光顯微鏡下每次計(jì)數(shù)精子不少于200個，每組試驗(yàn)重復(fù)5次以上，注意激發(fā)光波長在480 nm，發(fā)射光波長在530 nm。

4）精子DNA完整性檢測

使用AO熒光染色法檢測精子的DNA完整性。精子的前期處理同上，精液解凍，然后用PBS洗3遍，使精子濃度保持在5×106個/mL左右，取30 μL均勻涂在載玻片上，自然晾干后用無水乙醇-冰醋酸（3∶1）固定3 h，放入黑暗環(huán)境下新配的AO染液中10 min，PBS緩慢沖洗，黑暗中自然晾干后加石蠟油封片。200×熒光顯微鏡下每次計(jì)數(shù)精子不少于200個，每組試驗(yàn)重復(fù)5次以上，激發(fā)光波長在480 nm，發(fā)射光波長在530 nm。

5）線粒體活性檢測

使用碘化丙啶（PI）和羅丹明123（rhodamine 123，Rh123）共同染色判定。精子前處理同頂體完整性檢測。準(zhǔn)備100 μL PBS提前于37 ℃預(yù)熱，后續(xù)操作均在黑暗環(huán)境下進(jìn)行，在 PBS 中添加 1 μL PI和 1 μL Rh123，溫育10 min，隨后加入50 μL提前處理好的精液樣品，37 ℃水浴鍋中溫育30 min。取溫育好的樣品滴在載玻片上，蓋好蓋玻片，鏡檢，200×熒光顯微鏡下每次計(jì)數(shù)精子不少于200個，每組試驗(yàn)重復(fù)5次以上，激發(fā)光波長在488 nm，發(fā)射光波長在513 nm。

6） ROS水平檢測

使用DCFH-DA熒光染色法判定。精子前處理同頂體完整性檢測，離心去上清后使用DCFH-DA染液（10 μM，DMSO溶解）重懸，使精子濃度保持在5×106個/mL左右。精液樣品放入37 ℃水浴鍋中避光溫育30 min，用預(yù)熱后的PBS緩沖液洗3次，200×熒光顯微鏡下每次計(jì)數(shù)精子不少于200個，每組試驗(yàn)重復(fù)3次以上，激發(fā)光波長在504 nm，發(fā)射光波長在529 nm。

7）抗氧化酶活性、MDA水平檢測

CAT、SOD、GSH-Px的 檢 測和MDA水平的檢測使用試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，進(jìn)行試驗(yàn)時嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，每項(xiàng)檢測重復(fù)3遍以上。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA分析。本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異顯著。采用軟件Image J分析ROS水平。

2 結(jié)果

2.1 添加Res對解凍后精子質(zhì)量的影響

與對照組相比，在冷凍基礎(chǔ)液中添加 25 μM、50 μM Res均可顯著提高解凍后豬精子活力（P＜0.05）。當(dāng)添加100 μM Res時，與50μM組相比顯著下降（P＜0.05）。當(dāng)200 μM的Res添加濃度與各添加組相比，精子活力顯著下降，且顯著低于對照組（P＜0.05）。其中添加50 μM 組活力最高（圖1）。

與對照組相比，50 μM Res添加到冷凍基礎(chǔ)液中可以顯著提高解凍后豬精子質(zhì)膜完整率（P＜0.05），添加200 μM Res可以顯著降低解凍后豬精子質(zhì)膜完整 率（P＜ 0.05）， 添 加 25 μM、100 μM Res均可提高解凍后豬精子質(zhì)膜完整率，但差異不顯著（P＞0.05）（圖2）。

與對照組相比，在冷凍基礎(chǔ)液中添加50 μM Res可以顯著提高解凍后豬精子頂體完整率（P＜0.05），添加25 μM、100 μM Res均可提高解凍后豬精子頂體完整率但差異不顯著（P＞0.05），添加200 μM Res可以降低解凍后豬精子頂體完整率但差異不顯著（P＞0.05（）圖3）。

與對照組相比，在冷凍基礎(chǔ)液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可提高解凍后豬精子DNA完整率，但差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)Res添加濃度為100 μM時，DNA完整率最高。當(dāng)Res添加濃度為200 μM時，DNA完整率降低，但差異不顯著（P＞0.05）（圖4）。

與對照組相比，在冷凍基礎(chǔ)液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可顯著提高解凍后豬精子線粒體活率（P＜0.05），其中50 μM添加組線粒體活率最高，添加200 μM Res可以降低解凍后豬精子線粒體活率，但差異不顯著（P＞0.05）（圖5）。

2.2 添加Res對解凍后精子抗氧化酶、ROS水平、MDA水平的影響

與對照組相比，在冷凍基礎(chǔ)液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可顯著降低解凍后豬精子ROS水平（P＜0.05），當(dāng)濃度為50 μM時，ROS水平最低（圖6）。

與對照組相比，在冷凍基礎(chǔ)液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可顯著提高解凍后豬精子CAT活性（P＜0.05），其中Res添加濃度為50 μM時，CAT活性最高（圖7）。

與對照組相比，在冷凍基礎(chǔ)液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可顯著提高解凍后豬精子SOD活性（P＜0.05），其中Res添加濃度為50 μM時，SOD活性最高（圖8）。

與對照組相比，在冷凍基礎(chǔ)液 中 添 加 25 μM、50 μM、100 μM Res可以顯著提高解凍后豬精子GSH-Px活性（P＜0.05），其中Res添加濃度為50 μM時，GSHPx活性最高。當(dāng)Res添加濃度為200 μM時，GSH-Px活性下降，但差異不顯著（P＞0.05）（圖9）。

與對照組相比，在冷凍基礎(chǔ)液中添加25 μM、50 μM、100 μM Res均可顯著降低解凍后豬精子MDA水平（P＜0.05），其中Res添加濃度為50 μM時，MDA水平最低。當(dāng)Res添加濃度在200 μM時，MDA水平升高，但差異不顯著（P＞0.05）（圖10）。

3 討論

Res是可以從虎杖、葡萄等植物中得到的天然非黃酮類多酚抗氧化物質(zhì)。Res分子中含有酚羥基，可以電離出H+，具有較強(qiáng)的還原性，可以還原氧自由基，減少氧自由基的積累[12]。劉程[13]在研究中發(fā)現(xiàn)添加Res可以改善解凍后牛精液的質(zhì)量參數(shù)，包括活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率、總抗氧化能力、丙二醛水平、GSH-Px活性。Z. D. Zhu等[14]研究發(fā)現(xiàn)添加 50 μM Res，能顯著提高解凍后豬精子的運(yùn)動能力、膜完整率、頂體完整率、線粒體活率、GSH-Px活性、SOD活性、CAT活性等，可以降低解凍后精子的脂質(zhì)過氧化、ROS水平和凋亡率。證明Res可通過促進(jìn)5’-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶磷酸化，會導(dǎo)致精子ROS產(chǎn)生水平的降低，抗氧化防御系統(tǒng)在精子中被改善，精子受ROS的影響降低，損傷減小。該研究中發(fā)現(xiàn)添加50 μM Res可以顯著改善精液品質(zhì)，與Z. D. Zhu等人的研究結(jié)果一致。說明Res可以有效的應(yīng)用于豬精液冷凍保存。

精子在冷凍過程中會產(chǎn)生大量的ROS，這些氧自由基會攻擊精子膜、線粒體膜，DNA等，膜損傷導(dǎo)致信號傳遞、物質(zhì)交流等功能受損，DNA片段化導(dǎo)致遺傳信息傳遞障礙，最終導(dǎo)致凋亡。這些因素使得解凍后的精子品質(zhì)大大降低[15]。Res作為天然抗氧化劑可以減少ROS的積累，通過清除體內(nèi)氧自由基，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)會由此減弱，精子在冷凍過程中因氧化應(yīng)激而受到的損傷也會由此降低，最終精子品質(zhì)得到提升。

該研究將天然抗氧化劑Res應(yīng)用于豬的冷凍精液中，取得較好的效果，說明其可以在凍精實(shí)際生產(chǎn)中加以考慮，但是它們對精子保護(hù)的多效性機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

豬精液冷凍前添加Res可改良凍融后精子質(zhì)量，綜合各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，添加50μM Res效果最佳，在豬精液生產(chǎn)中具有重要意義。