劉 偉，魏松紅，朱麗珺，王海寧，張照茹，李昕洋

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

【研究意義】由稻梨孢(Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是目前世界分布最廣、危害最重的水稻病害之一[1]，近年來，我國遼寧地區(qū)稻瘟病的發(fā)生也呈現(xiàn)逐年加重的趨勢，已成為限制該地區(qū)水稻高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙之一[2]。選育和種植抗病品種是防治稻瘟病最有效的措施，水稻對(duì)稻瘟病的抗性類型大多數(shù)屬于小種?；共⌒裕芍餍Э共』蚩刂?，表現(xiàn)為質(zhì)量性狀，該類抗病類型抗病效能高，遺傳方式簡單，已成為廣泛應(yīng)用的主要抗病性類型[3-4]。小種?；共⌒苑螰lor 的“基因?qū)颉睂W(xué)說，即抗病基因(R基因)識(shí)別病原物的無毒基因(Avr基因)，引發(fā)不親和反應(yīng)[5]。由于稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，變異速率快，致病力分化嚴(yán)重，導(dǎo)致能克服寄主抗病性的群體快速形成優(yōu)勢，大多數(shù)抗病品種在大田推廣3～5年后即喪失抗性[6-8]。因此，鑒定稻瘟病菌的無毒基因和生理小種的動(dòng)態(tài)變化，有助于人們根據(jù)不同地區(qū)流行菌株的無毒基因型選擇具有相應(yīng)抗病基因的水稻品種進(jìn)行合理布局。【前人研究進(jìn)展】目前完成初步定位的稻瘟病菌無毒基因至少有40個(gè)，成功克隆的稻瘟病菌無毒基因有12個(gè)，分別為PWL1、PWL2、AVR1-CO39、Avr-Pita、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pia、Avr-Pii、Avr-Pik/km/kp、PWL2D、Avr-Pi9和Avr-Pib。劉翔等[9]對(duì)2014年分離自湖南桃江病圃麗江新團(tuán)黑谷的稻瘟病菌進(jìn)行無毒基因鑒定，結(jié)果表明：無毒基因Avr-Pita、Avr-Pish、Avr-Piz、Avr-Piz5、Avr-Pi3和Avr-Pi9出現(xiàn)頻率較高。王世維等[10]對(duì)2011年分離自遼寧地區(qū)的稻瘟病菌進(jìn)行無毒基因鑒定，結(jié)果表明：遼寧省稻瘟病菌主要無毒基因類型為Avr-pita、Avr-pik和AvrPiz-t，AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia在遼寧省的稻瘟病菌中均未檢測到。朱名海等[11]對(duì)2014-2015年分離自南繁核心區(qū)和非核心區(qū)的稻瘟病菌無毒基因攜帶情況進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明：無毒基因ACE1、Avr-Pik、Avr-Pita、Avr-Piz-t和PWL2在2個(gè)區(qū)域的稻瘟病菌中分布率較高，無毒基因Avr-Pia在南繁非核心區(qū)的稻瘟病菌中未檢測到?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)于2017-2018年采集遼寧省7個(gè)主產(chǎn)稻區(qū)穗頸瘟病標(biāo)樣740余份，通過單孢分離共獲得151株供試菌株，采用全國統(tǒng)一的1套7個(gè)鑒別品種，對(duì)供試菌株進(jìn)行生理小種鑒定，并對(duì)供試菌株進(jìn)行了10個(gè)稻瘟病菌無毒基因攜帶情況的PCR檢測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究結(jié)果可為指導(dǎo)遼寧地區(qū)水稻品種的選育、布局和輪用以及稻瘟病的綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：2017-2018年從遼寧省7個(gè)主產(chǎn)稻區(qū)(沈陽市、大連市、丹東市、營口市、盤錦市、鐵嶺市、撫順市)采集穗頸瘟標(biāo)樣740余份，通過病原菌常規(guī)分離和單孢純化共獲得151株供試菌株，其中沈陽25株、大連9株、丹東31株、營口2株、盤錦28株、鐵嶺34株、撫順22株。

供試水稻鑒別品種：特特普、珍龍13、四豐43、東農(nóng)363、關(guān)東51、合江18、麗江新團(tuán)黑谷。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL；PD培養(yǎng)液為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL；TOA培養(yǎng)基為燕麥片30 g，番茄汁200 mL，瓊脂30 g，蒸餾水1000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株生理小種鑒定 將活化的供試菌株轉(zhuǎn)接至TOA培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，配成孢子懸浮液(每毫升1×106個(gè)孢子)備用。將7個(gè)供試鑒別水稻品種培養(yǎng)至3葉1心期，參照張海旺等[12](2014)的方法進(jìn)行離體葉段劃傷接種，放置于人工氣候培養(yǎng)箱中，模擬7-8月水稻田間的氣候條件，培養(yǎng)8 d后，采用全國稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組(1980 年)制訂的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查，記載鑒別品種的抗(R)感(S)反應(yīng)類型[13]。

1.2.2 供試菌株無毒基因鑒定 將活化的供試菌株轉(zhuǎn)接至PD培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 d，收集菌絲并干燥，利用OMEGA公司真菌基因組DNA提取試劑盒(D3390-01)進(jìn)行供試菌株DNA提取。根據(jù)10個(gè)稻瘟病菌無毒基因序列，利用Primer 6和DNAMAN軟件設(shè)計(jì)引物并檢驗(yàn)，設(shè)計(jì)出10對(duì)不同無毒基因引物，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(30 μl)：E-taq酶0.15 μl，10×E-TaqBuffer(MgCl2)3 μl，正向引物和反向引物各0.12 μl(100 μg·mL-1)，dNTP 2 μl，DNA模板2 μl，ddH2O補(bǔ)足至30 μl。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55～61 ℃退火30 s，具體依據(jù)引物的G/C含量來定，72 ℃延伸30～60 s，具體依據(jù)目的片段長度而定，29個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測：取5 μl PCR產(chǎn)物與1.5×Loading buffer混合液(4∶1)混合后，在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，DuRed染色后，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

結(jié)合2010-2016年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群分布和動(dòng)態(tài)變化，對(duì)2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種進(jìn)行分析，結(jié)合2014-2016年遼寧省稻瘟病菌無毒基因分布和動(dòng)態(tài)變化，對(duì)2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種鑒定

由表2可知，供試151株稻瘟病菌經(jīng)鑒定劃分為6群41個(gè)生理小種。分別為ZA群的ZA1、ZA3、ZA5、ZA7、ZA9、ZA13、ZA17、ZA21、ZA25、ZA29、ZA31、ZA33、ZA37、ZA41、ZA49、ZA55、ZA57、ZA61，共18個(gè)小種；ZB群的ZB1、ZB3、ZB5、ZB9、ZB11、ZB13、ZB17、ZB19、ZB21、ZB23、ZB25、ZB29、ZB30、ZB31，共14個(gè)生理小種；ZC群的ZC1、ZC5、ZC11，共3個(gè)生理小種；ZD群的ZD1、ZD5、ZD7，共3個(gè)生理小種；ZE群的ZE1和ZE3，共2個(gè)生理小種；ZF群的ZF1，共1個(gè)生理小種。

表1 用于擴(kuò)增無毒基因的引物

表2 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種鑒定

續(xù)表2 Continued table 2

2.2 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因型鑒定

通過設(shè)計(jì)10對(duì)無毒基因特異性引物對(duì)151株稻瘟病菌進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明(表3)：AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia在遼寧省稻瘟病菌中未被發(fā)現(xiàn)，無毒基因Avr-Pita、AvrPiz-t、Avr-pik、PWL2和ACE1攜帶頻率較高，攜帶頻率分別為：90.07 %、94.04 %、93.38 %、92.72 %和98.68 %，無毒基因Avr-pib攜帶頻率較低，僅為27.81 %。

表3 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因鑒定

表4 2010-2018年遼寧省稻瘟病菌出現(xiàn)頻率

2.3 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群動(dòng)態(tài)變化

由表4可知，2010-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種組成中，ZA種群和ZB種群為優(yōu)勢種群，除2013年外，ZA種群均為第一優(yōu)勢種群。多數(shù)年份，ZF種群占比僅次于ZA種群和ZB種群，而在2012-2014年ZF種群占比明顯減少。ZC種群自2014年起占比明顯降低。ZD種群和ZE種群雖然在一定的范圍內(nèi)進(jìn)行波動(dòng)，但占比率一直較低。ZG種群僅在2012年出現(xiàn)，ZH種群一直未出現(xiàn)。

2.4 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因動(dòng)態(tài)變化

由表5可知，2014-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因組成中，Avr-pi9、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-pik、Avr-pita、PWL2攜帶頻率較高。Avr-pi9在2015年攜帶頻率有所下降，在其余年攜帶頻率均在90 %以上。Avr-pib攜帶頻率在2017年有較大幅度上升，為49.33 %，其2014、2015、2016和2018年出現(xiàn)頻率分別為2.00 %、13.00 %、10.00 %和6.58 %。2014-2018年均未檢測到無毒基因AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia。

2.5 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群分布

2017-2018年遼寧省稻瘟病菌種群監(jiān)測結(jié)果(表6)表明：鐵嶺、沈陽、丹東、撫順和盤錦地區(qū)稻瘟病菌生理小種種群組成復(fù)雜，分別為6群18個(gè)生理小種、6群18個(gè)生理小種、5群18個(gè)生理小種、5群11個(gè)生理小種和5群14個(gè)生理小種，大連和營口地區(qū)相對(duì)單一，分別為4群6個(gè)生理小種和1群2個(gè)生理小種。ZA種群和ZB種群不僅為遼寧地區(qū)的優(yōu)勢種群，在各個(gè)稻區(qū)也是優(yōu)勢種群。

表5 2014-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因出現(xiàn)頻率

表6 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群分布

表7 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因型地理分布

2.6 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因分布

2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因分布結(jié)果(表7)表明：所檢測的10個(gè)無毒基因，除AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia外，其它無毒基因在遼寧省各個(gè)稻區(qū)均檢測到。同一地區(qū)的不同無毒基因的攜帶頻率基本相同。

3 討 論

選育和種植抗瘟品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的措施之一，但是單一抗病品種長時(shí)間大面積推廣種植易對(duì)田間病原菌造成選擇壓力，促使生理小種發(fā)生變異，進(jìn)而造成品種抗性減退甚至喪失[14-15]。鑒于稻瘟病菌及其寄主在世界范圍內(nèi)的重要影響，現(xiàn)在已經(jīng)成為研究植物與病原菌間相互作用的模式生物。根據(jù)“基因?qū)颉睂W(xué)說，水稻中含有1個(gè)抗性基因(R基因)，在稻瘟病菌中就存在1個(gè)相對(duì)應(yīng)的無毒基因(Avr基因)。R基因通過識(shí)別Avr基因，啟動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)，從而激發(fā)水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。所以只有在水稻中含有R基因，而同時(shí)稻瘟病菌中含有相對(duì)應(yīng)的Avr基因，水稻才表現(xiàn)抗瘟性。水稻抗瘟性研究需要從寄主的抗病基因和稻瘟病菌的無毒基因同時(shí)入手，才能系統(tǒng)地解決水稻抗稻瘟病的問題。本研究利用7個(gè)水稻鑒別品種對(duì)2017-2018年采自遼寧省各個(gè)稻區(qū)的151株稻瘟病菌進(jìn)行生理小種鑒定，并根據(jù)已克隆的10個(gè)稻瘟病菌無毒基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明：供試菌株被劃分為6群41個(gè)生理小種，ZA和ZB為優(yōu)勢種群，未檢測到ZG種群。供試菌株全部攜帶無毒基因Avr-Pi9，大部分菌株攜帶無毒基因Avr-Pita、AvrPiz-t、Avr-pik、PWL2和ACE1，無毒基因Avr-pib攜帶頻率較低，無毒基因Avr-Pii、Avr-CO39和Avr-Pia未檢測到。

鐘寶玉等[16]從2006-2015年近10年間收集并分離了廣東各地稻瘟病菌3690個(gè)，經(jīng)接種到中國稻瘟病菌鑒別品種上共鑒定出8群51個(gè)生理小種，其中以ZB群、ZC群和ZG群為主要優(yōu)勢種群；陳小林等[17]利用我國7個(gè)稻瘟病菌鑒別品種對(duì)廣西2012-2014年分離獲得的稻瘟病菌進(jìn)行生理小種鑒定。結(jié)果表明：2012-2014年分離獲得的142株稻瘟病菌菌株分為7群24個(gè)生理小種，其中優(yōu)勢種群為ZB，優(yōu)勢生理小種為ZB9和ZB13；沈樂融等[18]針對(duì)2013-2017年從江蘇省采集標(biāo)樣并分離得到的共計(jì)621個(gè)稻瘟病菌菌株，利用10對(duì)稻瘟病菌無毒基因(PWL1、AVR1-CO39、Avr-Pita、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pia、Avr-Pii、Avr-Pik、Avr-Pi9和Avr-Pib)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，分析了江蘇省稻瘟病菌無毒基因的分布及頻率，結(jié)果表明：上述10個(gè)無毒基因在江蘇省均有分布，但出現(xiàn)頻率不同，其中平均擴(kuò)增頻率最高的為Avr-Pib，最低的是Avr-Pia；李祥曉等[19]采用7個(gè)稻瘟病菌無毒基因(AVR1-CO39、Avr-Pita、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pia、Avr-Pit和Avr-Pik)特異性引物，對(duì)177個(gè)采自黑龍江省的稻瘟病菌菌株進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明：7個(gè)無毒基因在黑龍江省不同地區(qū)均有分布，但出現(xiàn)頻率不同，其中頻率最高的為ACE1，達(dá)到最低的為AVR1-CO39。由以上可知，不同地區(qū)稻瘟病菌生理小種和無毒基因組成差異較大，這種不同是由于水稻種植品種變化、品種抗性變化及氣候變化等綜合因素影響的結(jié)果。

除了地區(qū)差異外，不同寄主的稻梨孢中無毒基因組成情況也具有較大差異，余歡等[20]對(duì)35株草類寄主的梨孢菌進(jìn)行無毒基因型分析，結(jié)果表明：所有供試菌株均沒有Avr-Pik/km/kp、PWL3和PWL4基因，以馬唐為寄主的菌株中沒有ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pita1和PWL1；以牛筋草為寄主的菌株中沒有Avr-Pia、Avr-Pita1、Avr-Pita2和PWL2；以狗尾草為寄主的菌株中沒有Avr-Pii、Avr-Pita、PWL1和PWL2。無毒基因Avr-CO39可與水稻抗性基因Pi-CO39(t)相互識(shí)別，引起水稻的過敏性壞死反應(yīng)[21]。但Avr-CO39存在于稻瘟病菌的進(jìn)化早期，并在稻屬專化型的進(jìn)化過程中由于發(fā)生轉(zhuǎn)座子插入，使得稻瘟病菌喪失了Avr-CO39活性。稻瘟病菌中并未發(fā)現(xiàn)具有完整Avr-CO39序列的菌株。而其他寄主的梨孢菌具有完整的Avr-CO39結(jié)構(gòu)[22-23]。

4 結(jié) 論

由于稻瘟病菌生理小種和無毒基因的多樣性和易變性，極易導(dǎo)致優(yōu)良抗瘟水稻品種喪失抗性，水稻品種的抗瘟持久性與其所在地區(qū)稻瘟菌生理小種和無毒基因的變化緊密相關(guān)[24]。因此，開展不同地區(qū)稻瘟病菌生理小種和無毒基因組成和動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測，引導(dǎo)水稻品種的合理布局，是有效預(yù)防稻瘟病流行的重要手段，也是稻瘟病可持續(xù)治理的長期性工作。遼寧省稻瘟病菌生理小種和無毒基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在遼寧省水稻品種布局中，應(yīng)推廣含有Pita、Pi9、Pizt和Pik抗性基因的水稻品種。