劉 偉，魏松紅，朱麗珺，王海寧，張照茹，李昕洋

(沈陽農業(yè)大學植物保護學院，遼寧 沈陽 110866)

【研究意義】由稻梨孢(Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是目前世界分布最廣、危害最重的水稻病害之一[1]，近年來，我國遼寧地區(qū)稻瘟病的發(fā)生也呈現逐年加重的趨勢，已成為限制該地區(qū)水稻高產和穩(wěn)產的主要障礙之一[2]。選育和種植抗病品種是防治稻瘟病最有效的措施，水稻對稻瘟病的抗性類型大多數屬于小種?；共⌒?，由主效抗病基因控制，表現為質量性狀，該類抗病類型抗病效能高，遺傳方式簡單，已成為廣泛應用的主要抗病性類型[3-4]。小種?；共⌒苑螰lor 的“基因對基因”學說，即抗病基因(R基因)識別病原物的無毒基因(Avr基因)，引發(fā)不親和反應[5]。由于稻瘟病菌群體結構復雜，變異速率快，致病力分化嚴重，導致能克服寄主抗病性的群體快速形成優(yōu)勢，大多數抗病品種在大田推廣3～5年后即喪失抗性[6-8]。因此，鑒定稻瘟病菌的無毒基因和生理小種的動態(tài)變化，有助于人們根據不同地區(qū)流行菌株的無毒基因型選擇具有相應抗病基因的水稻品種進行合理布局?！厩叭搜芯窟M展】目前完成初步定位的稻瘟病菌無毒基因至少有40個，成功克隆的稻瘟病菌無毒基因有12個，分別為PWL1、PWL2、AVR1-CO39、Avr-Pita、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pia、Avr-Pii、Avr-Pik/km/kp、PWL2D、Avr-Pi9和Avr-Pib。劉翔等[9]對2014年分離自湖南桃江病圃麗江新團黑谷的稻瘟病菌進行無毒基因鑒定，結果表明：無毒基因Avr-Pita、Avr-Pish、Avr-Piz、Avr-Piz5、Avr-Pi3和Avr-Pi9出現頻率較高。王世維等[10]對2011年分離自遼寧地區(qū)的稻瘟病菌進行無毒基因鑒定，結果表明：遼寧省稻瘟病菌主要無毒基因類型為Avr-pita、Avr-pik和AvrPiz-t，AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia在遼寧省的稻瘟病菌中均未檢測到。朱名海等[11]對2014-2015年分離自南繁核心區(qū)和非核心區(qū)的稻瘟病菌無毒基因攜帶情況進行PCR檢測。結果表明：無毒基因ACE1、Avr-Pik、Avr-Pita、Avr-Piz-t和PWL2在2個區(qū)域的稻瘟病菌中分布率較高，無毒基因Avr-Pia在南繁非核心區(qū)的稻瘟病菌中未檢測到。【本研究切入點】本試驗于2017-2018年采集遼寧省7個主產稻區(qū)穗頸瘟病標樣740余份，通過單孢分離共獲得151株供試菌株，采用全國統一的1套7個鑒別品種，對供試菌株進行生理小種鑒定，并對供試菌株進行了10個稻瘟病菌無毒基因攜帶情況的PCR檢測?！緮M解決的關鍵問題】研究結果可為指導遼寧地區(qū)水稻品種的選育、布局和輪用以及稻瘟病的綜合防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：2017-2018年從遼寧省7個主產稻區(qū)(沈陽市、大連市、丹東市、營口市、盤錦市、鐵嶺市、撫順市)采集穗頸瘟標樣740余份，通過病原菌常規(guī)分離和單孢純化共獲得151株供試菌株，其中沈陽25株、大連9株、丹東31株、營口2株、盤錦28株、鐵嶺34株、撫順22株。

供試水稻鑒別品種：特特普、珍龍13、四豐43、東農363、關東51、合江18、麗江新團黑谷。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL；PD培養(yǎng)液為馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL；TOA培養(yǎng)基為燕麥片30 g，番茄汁200 mL，瓊脂30 g，蒸餾水1000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試菌株生理小種鑒定 將活化的供試菌株轉接至TOA培養(yǎng)基進行產孢培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后，配成孢子懸浮液(每毫升1×106個孢子)備用。將7個供試鑒別水稻品種培養(yǎng)至3葉1心期，參照張海旺等[12](2014)的方法進行離體葉段劃傷接種，放置于人工氣候培養(yǎng)箱中，模擬7-8月水稻田間的氣候條件，培養(yǎng)8 d后，采用全國稻瘟病菌生理小種聯合試驗組(1980 年)制訂的統一標準進行調查，記載鑒別品種的抗(R)感(S)反應類型[13]。

1.2.2 供試菌株無毒基因鑒定 將活化的供試菌株轉接至PD培養(yǎng)液中培養(yǎng)8 d，收集菌絲并干燥，利用OMEGA公司真菌基因組DNA提取試劑盒(D3390-01)進行供試菌株DNA提取。根據10個稻瘟病菌無毒基因序列，利用Primer 6和DNAMAN軟件設計引物并檢驗，設計出10對不同無毒基因引物，引物序列見表1。PCR反應體系(30 μl)：E-taq酶0.15 μl，10×E-TaqBuffer(MgCl2)3 μl，正向引物和反向引物各0.12 μl(100 μg·mL-1)，dNTP 2 μl，DNA模板2 μl，ddH2O補足至30 μl。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55～61 ℃退火30 s，具體依據引物的G/C含量來定，72 ℃延伸30～60 s，具體依據目的片段長度而定，29個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測：取5 μl PCR產物與1.5×Loading buffer混合液(4∶1)混合后，在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，DuRed染色后，在凝膠成像系統下拍照。

1.3 數據分析

結合2010-2016年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群分布和動態(tài)變化，對2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種進行分析，結合2014-2016年遼寧省稻瘟病菌無毒基因分布和動態(tài)變化，對2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因進行分析。

2 結果與分析

2.1 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種鑒定

由表2可知，供試151株稻瘟病菌經鑒定劃分為6群41個生理小種。分別為ZA群的ZA1、ZA3、ZA5、ZA7、ZA9、ZA13、ZA17、ZA21、ZA25、ZA29、ZA31、ZA33、ZA37、ZA41、ZA49、ZA55、ZA57、ZA61，共18個小種；ZB群的ZB1、ZB3、ZB5、ZB9、ZB11、ZB13、ZB17、ZB19、ZB21、ZB23、ZB25、ZB29、ZB30、ZB31，共14個生理小種；ZC群的ZC1、ZC5、ZC11，共3個生理小種；ZD群的ZD1、ZD5、ZD7，共3個生理小種；ZE群的ZE1和ZE3，共2個生理小種；ZF群的ZF1，共1個生理小種。

表1 用于擴增無毒基因的引物

表2 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種鑒定

續(xù)表2 Continued table 2

2.2 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因型鑒定

通過設計10對無毒基因特異性引物對151株稻瘟病菌進行PCR檢測，結果表明(表3)：AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia在遼寧省稻瘟病菌中未被發(fā)現，無毒基因Avr-Pita、AvrPiz-t、Avr-pik、PWL2和ACE1攜帶頻率較高，攜帶頻率分別為：90.07 %、94.04 %、93.38 %、92.72 %和98.68 %，無毒基因Avr-pib攜帶頻率較低，僅為27.81 %。

表3 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因鑒定

表4 2010-2018年遼寧省稻瘟病菌出現頻率

2.3 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群動態(tài)變化

由表4可知，2010-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種組成中，ZA種群和ZB種群為優(yōu)勢種群，除2013年外，ZA種群均為第一優(yōu)勢種群。多數年份，ZF種群占比僅次于ZA種群和ZB種群，而在2012-2014年ZF種群占比明顯減少。ZC種群自2014年起占比明顯降低。ZD種群和ZE種群雖然在一定的范圍內進行波動，但占比率一直較低。ZG種群僅在2012年出現，ZH種群一直未出現。

2.4 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因動態(tài)變化

由表5可知，2014-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因組成中，Avr-pi9、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-pik、Avr-pita、PWL2攜帶頻率較高。Avr-pi9在2015年攜帶頻率有所下降，在其余年攜帶頻率均在90 %以上。Avr-pib攜帶頻率在2017年有較大幅度上升，為49.33 %，其2014、2015、2016和2018年出現頻率分別為2.00 %、13.00 %、10.00 %和6.58 %。2014-2018年均未檢測到無毒基因AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia。

2.5 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群分布

2017-2018年遼寧省稻瘟病菌種群監(jiān)測結果(表6)表明：鐵嶺、沈陽、丹東、撫順和盤錦地區(qū)稻瘟病菌生理小種種群組成復雜，分別為6群18個生理小種、6群18個生理小種、5群18個生理小種、5群11個生理小種和5群14個生理小種，大連和營口地區(qū)相對單一，分別為4群6個生理小種和1群2個生理小種。ZA種群和ZB種群不僅為遼寧地區(qū)的優(yōu)勢種群，在各個稻區(qū)也是優(yōu)勢種群。

表5 2014-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因出現頻率

表6 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌生理小種種群分布

表7 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因型地理分布

2.6 2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因分布

2017-2018年遼寧省稻瘟病菌無毒基因分布結果(表7)表明：所檢測的10個無毒基因，除AVR1-CO39、Avr-pii和Avr-pia外，其它無毒基因在遼寧省各個稻區(qū)均檢測到。同一地區(qū)的不同無毒基因的攜帶頻率基本相同。

3 討 論

選育和種植抗瘟品種是防治稻瘟病最經濟有效的措施之一，但是單一抗病品種長時間大面積推廣種植易對田間病原菌造成選擇壓力，促使生理小種發(fā)生變異，進而造成品種抗性減退甚至喪失[14-15]。鑒于稻瘟病菌及其寄主在世界范圍內的重要影響，現在已經成為研究植物與病原菌間相互作用的模式生物。根據“基因對基因”學說，水稻中含有1個抗性基因(R基因)，在稻瘟病菌中就存在1個相對應的無毒基因(Avr基因)。R基因通過識別Avr基因，啟動防衛(wèi)反應，從而激發(fā)水稻對稻瘟病菌的抗性。所以只有在水稻中含有R基因，而同時稻瘟病菌中含有相對應的Avr基因，水稻才表現抗瘟性。水稻抗瘟性研究需要從寄主的抗病基因和稻瘟病菌的無毒基因同時入手，才能系統地解決水稻抗稻瘟病的問題。本研究利用7個水稻鑒別品種對2017-2018年采自遼寧省各個稻區(qū)的151株稻瘟病菌進行生理小種鑒定，并根據已克隆的10個稻瘟病菌無毒基因序列設計引物，對供試菌株進行PCR檢測。結果表明：供試菌株被劃分為6群41個生理小種，ZA和ZB為優(yōu)勢種群，未檢測到ZG種群。供試菌株全部攜帶無毒基因Avr-Pi9，大部分菌株攜帶無毒基因Avr-Pita、AvrPiz-t、Avr-pik、PWL2和ACE1，無毒基因Avr-pib攜帶頻率較低，無毒基因Avr-Pii、Avr-CO39和Avr-Pia未檢測到。

鐘寶玉等[16]從2006-2015年近10年間收集并分離了廣東各地稻瘟病菌3690個，經接種到中國稻瘟病菌鑒別品種上共鑒定出8群51個生理小種，其中以ZB群、ZC群和ZG群為主要優(yōu)勢種群；陳小林等[17]利用我國7個稻瘟病菌鑒別品種對廣西2012-2014年分離獲得的稻瘟病菌進行生理小種鑒定。結果表明：2012-2014年分離獲得的142株稻瘟病菌菌株分為7群24個生理小種，其中優(yōu)勢種群為ZB，優(yōu)勢生理小種為ZB9和ZB13；沈樂融等[18]針對2013-2017年從江蘇省采集標樣并分離得到的共計621個稻瘟病菌菌株，利用10對稻瘟病菌無毒基因(PWL1、AVR1-CO39、Avr-Pita、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pia、Avr-Pii、Avr-Pik、Avr-Pi9和Avr-Pib)特異性引物進行擴增，分析了江蘇省稻瘟病菌無毒基因的分布及頻率，結果表明：上述10個無毒基因在江蘇省均有分布，但出現頻率不同，其中平均擴增頻率最高的為Avr-Pib，最低的是Avr-Pia；李祥曉等[19]采用7個稻瘟病菌無毒基因(AVR1-CO39、Avr-Pita、ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pia、Avr-Pit和Avr-Pik)特異性引物，對177個采自黑龍江省的稻瘟病菌菌株進行PCR檢測，結果表明：7個無毒基因在黑龍江省不同地區(qū)均有分布，但出現頻率不同，其中頻率最高的為ACE1，達到最低的為AVR1-CO39。由以上可知，不同地區(qū)稻瘟病菌生理小種和無毒基因組成差異較大，這種不同是由于水稻種植品種變化、品種抗性變化及氣候變化等綜合因素影響的結果。

除了地區(qū)差異外，不同寄主的稻梨孢中無毒基因組成情況也具有較大差異，余歡等[20]對35株草類寄主的梨孢菌進行無毒基因型分析，結果表明：所有供試菌株均沒有Avr-Pik/km/kp、PWL3和PWL4基因，以馬唐為寄主的菌株中沒有ACE1、Avr-Piz-t、Avr-Pita1和PWL1；以牛筋草為寄主的菌株中沒有Avr-Pia、Avr-Pita1、Avr-Pita2和PWL2；以狗尾草為寄主的菌株中沒有Avr-Pii、Avr-Pita、PWL1和PWL2。無毒基因Avr-CO39可與水稻抗性基因Pi-CO39(t)相互識別，引起水稻的過敏性壞死反應[21]。但Avr-CO39存在于稻瘟病菌的進化早期，并在稻屬?；偷倪M化過程中由于發(fā)生轉座子插入，使得稻瘟病菌喪失了Avr-CO39活性。稻瘟病菌中并未發(fā)現具有完整Avr-CO39序列的菌株。而其他寄主的梨孢菌具有完整的Avr-CO39結構[22-23]。

4 結 論

由于稻瘟病菌生理小種和無毒基因的多樣性和易變性，極易導致優(yōu)良抗瘟水稻品種喪失抗性，水稻品種的抗瘟持久性與其所在地區(qū)稻瘟菌生理小種和無毒基因的變化緊密相關[24]。因此，開展不同地區(qū)稻瘟病菌生理小種和無毒基因組成和動態(tài)變化監(jiān)測，引導水稻品種的合理布局，是有效預防稻瘟病流行的重要手段，也是稻瘟病可持續(xù)治理的長期性工作。遼寧省稻瘟病菌生理小種和無毒基因組成結構復雜，在遼寧省水稻品種布局中，應推廣含有Pita、Pi9、Pizt和Pik抗性基因的水稻品種。