李 杰，張星星，孟慶玲，喬 軍*，李 妍，王曉婷，李 靜，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)是一種重要的食源性病原菌之一，廣泛分布于自然界，能在外界環(huán)境中長期存活[1]。人類通過食用被感染的食物經(jīng)消化道感染機體，引起感染者發(fā)生敗血癥、腦膜炎、胃腸炎、流產(chǎn)等嚴(yán)重疾病；免疫能力低下者感染后死亡率較高[2-3]。LM能在0.4 ～ 45 ℃、pH值2.5、滲透壓高、20 % NaCl和0.025 %過氧化氫等極端環(huán)境中生長和生存[1,4-5]，是動物源性食品生產(chǎn)加工過程中的常見污染菌，對食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅?！厩叭搜芯窟M展】為了適應(yīng)不同環(huán)境，LM轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)從而改變其環(huán)境適應(yīng)能力[8-9]。目前，已在LM中鑒定出多種環(huán)境調(diào)控因子，其中prfA和sigB在環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中扮演重要角色，它們通過調(diào)節(jié)抗性基因的轉(zhuǎn)錄使LM適應(yīng)各種不利環(huán)境[6-9]。此外，HrcA和CtsR也參與應(yīng)激反應(yīng)基因的調(diào)控[10-12]；SOS作為修復(fù)受損DNA的一種機制，而RecA和LexA分別控制SOS反應(yīng)的激活和抑制，也參與了對環(huán)境脅迫的適應(yīng)性[16-17]，有研究發(fā)現(xiàn)，AraC家族是存在于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌中的一種轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)菌一些基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用，參與細(xì)菌毒力的調(diào)控及抵抗不良應(yīng)激環(huán)境[6,15]。該家族中的螺旋-旋轉(zhuǎn)-螺旋(HTH) DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與基因的啟動子結(jié)合，激活基因轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮調(diào)控作用[16-17]。前期的生物信息學(xué)分析表明，lmo2672屬于AraC家族成員，然而目前LMlmo2672具體的生物學(xué)功能尚不清楚。【本研究切入點】本研究利用構(gòu)建的lmo2672基因缺失株，比較LM EGD-e與LM-Δlmo2672在不同應(yīng)激環(huán)境中環(huán)境適應(yīng)能力，通過qRT-PCR分析了應(yīng)激調(diào)節(jié)因子(prfA、sigB、ctsR、hrcA、lexA、recA)和氧化應(yīng)激相關(guān)基因(fri、kat、perR、sod)轉(zhuǎn)錄水平的變化，探討了lmo2672對LM氧化環(huán)境中的調(diào)控作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為進一步揭示AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Lmo2672在LM中的作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

LM EGD-e菌株由德國伍茲堡大學(xué)W. Goebel惠贈；pKSV7由本實驗室保存；pMD19-T載體、T4連接酶、限制性酶切酶KpnI和PstI購自TaKaRa公司，基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購自TIANGEN生物有限公司，氯霉素、膽汁酸鹽購自Sigma公司，氯化鈉購自天津盛奧生物試劑公司，腦心浸出液(BHI)購自青島海博生物科技有限公司。

1.2 引物

根據(jù)GenBank發(fā)表的LM標(biāo)準(zhǔn)株(LM EGD-e)基因組序列(登錄號：AL591824.1)，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計LM缺失株的構(gòu)建、鑒定及qRT-PCR相關(guān)引物，其中R1和R4引物的5’端分別引入酶切位點KpnI和PstI (斜體下劃線部分)，引物均由北京華大基因公司合成 (表1)。

表1 本研究中所用引物

續(xù)表1 Continued table 1

1.3 LM-Δlmo2672缺失株的構(gòu)建與鑒定

采用基因組DNA提取試劑盒提取LM EGD-e菌株的基因組DNA，以DNA為模板，利用引物R1/R2、R3/R4分別擴增lmo2672基因的上、下游同源臂，將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，根據(jù)膠回收試劑盒的操作步驟進行回收，將上、下游臂的膠回收產(chǎn)物進行融合，獲得缺失目的基因的融合片段。將其與溫控質(zhì)粒pKSV7進行16 ℃過夜連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δlmo2672。將pKSV7-Δlmo2672電轉(zhuǎn)至LM感受態(tài)細(xì)胞中，在氯霉素和42 ℃雙重抗性下進行同源重組獲得缺失株，對獲得的LM-Δlmo2672缺失株用旁外側(cè)引物R5/R6檢測并測序進行鑒定。同時將LM-Δlmo2672缺失株在無氯霉素抗性，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20代并用R5/R6進行PCR檢測其遺傳穩(wěn)定性。

1.4 lmo2672基因缺失對LM在不同應(yīng)激環(huán)境中適應(yīng)能力的影響

分別挑取LM EGD-e和LM-Δlmo2672單菌落過夜培養(yǎng)，調(diào)整菌液OD600約為0.4，分別接種于新鮮BHI培養(yǎng)基放置于不同溫度(37、42 ℃)，或者分別在37 ℃接種于含5 % NaCl、0.3 %膽酸鹽、5 mM H2O2、1 % Triton X-100的BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每株菌設(shè)置3個平行，每2 h測定其OD600 nm以代表菌株生長情況，繪制生長曲線比較LM EGD-e和LM-Δlmo2672生長曲線。

1.5 RNA的提取及cDNA的合成

將待測菌株在37 ℃，180 r/min過夜振蕩培養(yǎng)，離心收集菌體，用含5 mM H2O2BHI調(diào)整菌液OD600至0.6，并放置37 ℃暴露于H2O2環(huán)境中30 min；離心收集菌體，用液氮研磨至粉狀；根據(jù)Trizol法的操作分別提取LM EGD-e和LM-Δlmo2672細(xì)菌總RNA；使用Nanodrop 2000測量RNA濃度，并通過260/280和230/260 nm的比值以評估RNA是否被蛋白質(zhì)和有機物污染。同時利用兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，得到終體積為20 μl的cDNA；并用Nanodrop 2000分光光度計測定cDNA濃度。

1.6 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR分析

以統(tǒng)一濃度的cDNA為模板，以管家基因rpoB作為內(nèi)參，在LightCycler 480儀器上進行qRT-PCR，反應(yīng)采用SYBR Green Ⅰ Master mix和1.0 μM濃度的引物進行。測定6個環(huán)境應(yīng)激調(diào)控相關(guān)基因(prfA、sigB、ctsR、hrcA、lexA、recA)和4個氧化應(yīng)激相關(guān)基因(perR、kat、sod、fri)的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCT的方法計算各個基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。本試驗進行3次獨立重復(fù)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 5.0進行組間差異顯著性分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。P<0.05被認(rèn)為差異顯著，P<0.01被認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LM-Δlmo2672的構(gòu)建、鑒定及遺傳穩(wěn)定性分析

利用R5/R6引物篩選擴增出1502 bp條帶的重組菌株(圖1)；同時進行測序，測序結(jié)果進一步證明成功構(gòu)建LM-Δlmo2672缺失株。在37 ℃、無氯霉素抗性的培養(yǎng)基中繼續(xù)傳20代，R5/R6引物檢測均可擴增出1502 bp單一片段(圖2)，表明LM-Δlmo2672具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2 lmo2672基因缺失對LM環(huán)境適應(yīng)能力的影響

在37和42 ℃條件下，在37 ℃更適應(yīng)LM菌生長，且2株菌的生長趨勢相同，在細(xì)菌對數(shù)生長期中， LM-Δlmo2672的生長顯著慢于LM EGD-e(P< 0.05，圖3-A、圖3-B)；在含5 % NaCl培養(yǎng)基中，0～6 h LM EGD-e和LM-Δlmo2672幾乎不生長，在6 h之后LM-Δlmo2672生長速度顯著低于LM EGD-e(P<0.05，圖3-C)。在1 % Triton X-100 BHI中, 與LM EGD-e相比，LM-Δlmo2672在6～12 h內(nèi)生長差異顯著(P<0.05，圖3-D)；在含0.3 %的膽酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h以后，2株菌生長情況差異顯著(P<0.01，圖3-E)；在含5 mM H2O2BHI培養(yǎng)基中LM-Δlmo2672不生長，極顯著低于親本株LM EGD-e(P<0.01，圖3-F)，表明lmo2672缺失降低了LM的環(huán)境適應(yīng)能力。

M：DNA Marker DL-2000；1：LM EGD-e；2～3：LM-Δlmo2672重組菌；4：陰性對照;5.LM EGD-e圖1 LM-Δlmo2672重組菌的鑒定Fig.1 Identification of recombinant LM-Δlmo2672

2.3 環(huán)境應(yīng)激調(diào)控基因及氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的測定

在H2O2環(huán)境中暴露30 min后進行轉(zhuǎn)錄水平分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與LM EGD-e相比，LM-Δlmo2672中recA和fri基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，表明在氧化環(huán)境中l(wèi)mo2672缺失能誘導(dǎo)recA和fri基因的轉(zhuǎn)錄水平；除recA和fri基因外，其余基因的表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的降低，其中prfA，lexA，fri，perR，kat，sod差異顯著(P<0.05，圖4)，表明lmo2672對LM環(huán)境應(yīng)激和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平有影響。

M：DNA Marker DL-2000；1～3：LM-Δlmo2672重組菌；4：陰性對照；5：LM EGD-e圖2 LM-Δlmo2672重組菌遺傳穩(wěn)定性的檢測Fig.2 Analysis of genetic stability of LM-Δlmo2672

3 討 論

LM具有極強的環(huán)境適應(yīng)能力，能夠在食品加工、貯藏、運輸?shù)葢?yīng)激環(huán)境條件生存[18-19]。為了適應(yīng)不同的應(yīng)激環(huán)境，LM依靠眾多的調(diào)控因子進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在大腸桿菌中研究發(fā)現(xiàn)，AraC家族蛋白在細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮了調(diào)控作用。AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Rob通過上調(diào)micF使大腸桿菌對膽汁酸產(chǎn)生耐受[20-21]；Pletzer等人發(fā)現(xiàn)AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OpiA過表達(dá)時對大腸桿菌在pH和高滲透壓環(huán)境的耐受性顯著增加[17]。然而，目前LMAraC家族成員Lmo2672的生物學(xué)作用至今尚不清楚。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建LM-Δlmo2672缺失株，測定在不同應(yīng)激環(huán)境中LM EGD-e和LM-Δlmo2672的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LM-Δlmo2672在37 ℃、42 ℃、5 % NaCl、0.3 %膽酸鹽、5 mM H2O2及1 % Triton X-100的培養(yǎng)基中生長顯著低于LM EGD-e，提示AraC家族Lmo2672在LM環(huán)境適應(yīng)和應(yīng)激過程中發(fā)揮了調(diào)控作用。

A～F：分別為42 ℃，37 ℃，5% NaCl，1 % TrionX-100，0.3 %膽酸鹽，5 mM H2O2環(huán)境中的生長情況圖3 不同應(yīng)激環(huán)境對LM EGD-e和LM-Δlmo2672生長曲線的影響Fig.3 Growth curves of LM EGD-e and the LM-Δlmo2672 deletion mutant strains at different environmental stresses

圖4 氧化應(yīng)激環(huán)境下LM EGD-e和LM-Δlmo2672壓力調(diào)控相關(guān)基因及氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.4 Relative transcriptional levels of the genes related to stress regulator and oxidative stress response in the LM EGD-e and LM-Δlmo2672 under the oxidative stress

在外界環(huán)境中，LM常暴露于氧化應(yīng)激中，為了防止氧化應(yīng)激引起的損傷，細(xì)菌自身的防御系統(tǒng)可通過啟動相關(guān)的抗氧化機制來抵御ROS[22-23]。清除活性氧組分的超氧化物歧化酶(sod)將高活性的超氧化物轉(zhuǎn)化為過氧化氫，過氧化氫又被過氧化氫酶(kat)轉(zhuǎn)化為水和氧[24]；fri編碼類鐵蛋白Dps，據(jù)報道Dps在保護細(xì)胞抵御ROS時有雙重作用，它可以直接與DNA結(jié)合調(diào)控應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，以保護細(xì)菌免受H2O2的傷害[25]。研究表明，在不同的環(huán)境應(yīng)激(例如熱應(yīng)激、冷應(yīng)激、膽酸鹽應(yīng)激)中均可誘導(dǎo)fri基因的表達(dá)[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激作用下，fri基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯改變，表明該基因參與了抵御氧脅迫的作用。有研究表明，外源性ROS造成的DNA損傷會誘導(dǎo)recA基因的表達(dá)啟動SOS反應(yīng)機制以適應(yīng)氧脅迫環(huán)境[26-28]。本研究中發(fā)現(xiàn)，lmo2672基因缺失后，recA基因轉(zhuǎn)錄水平顯著增強，推測可能是通過recA基因的高表達(dá)來啟動SOS反應(yīng)，從而維持其生存，提示lmo2672可通過調(diào)控recA基因的表達(dá)以抵抗環(huán)境應(yīng)激。

4 結(jié) 論

總之，本研究通過構(gòu)建LM AraC家族lmo2672基因缺失株，證實了LM-Δlmo2672缺失株通過調(diào)控環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，顯著降低抵抗環(huán)境應(yīng)激的能力，尤其在氧化應(yīng)激環(huán)境中，LM-Δlmo2672缺失株fri及recA基因被誘導(dǎo)高表達(dá)，表明lmo2672基因在適應(yīng)氧化應(yīng)激環(huán)境中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，為進一步探究LMlmo2672調(diào)控應(yīng)激環(huán)境的分子機制奠定基礎(chǔ)。