陳裕坤 林曉藝 賴鐘雄

摘? 要：龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)是研究木本植物胚胎發(fā)生的優(yōu)良體系，為研究龍眼體胚發(fā)生的分子調(diào)控機制和龍眼分子育種奠定基礎。本文就龍眼胚性愈傷組織誘導與離體保存、高頻體胚發(fā)生與植株再生、體胚同步化調(diào)控與組織形態(tài)學觀察，體胚發(fā)生過程生理生化變化與代謝物積累、蛋白質(zhì)組和全轉(zhuǎn)錄組測序分析、DNA甲基化研究，體胚發(fā)生相關(guān)基因克隆、全基因組鑒定及其表達模式與功能，以及遺傳轉(zhuǎn)化等相關(guān)研究進行綜述，并對其研究前景進行展望。

關(guān)鍵詞：龍眼;體胚發(fā)生;基因克隆;分子機制;全轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學;DNA甲基化

中圖分類號：S667.2? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： Longan somatic embryogenesis （SE） system is an excellent system for studying embryogenesis in woody plants， which lays the foundation for studying the molecular regulation mechanism during SE and molecular breeding of longan. Accordingly， the induction of embryogenic callus and in vitro conservation， high-frequency SE and plant regeneration， regulation of synchronization somatic embryo and histomorphological observation in longan， the physiological， biochemical changes， and metabolite accumulation， proteomic and whole transcriptomics analysis by RNA-seq， DNA methylation during SE， SE-related genes cloning and genome-wide identification， expression pattern and function study of SE-related genes， research on genetic transformation of SE system in longan， were reviewed in this paper. Meanwhile， the research prospect of longan SE was analyzed and prospected.

Keywords： Dimocarpus longan Lour.; somatic embryogenesis; gene cloning; molecular mechanism; whole-transcriptomics and proteomics; DNA methylation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.10.006

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是我國著名的熱帶亞熱帶特色木本果樹，龍眼果實富含酚類等次生代謝物，被譽為“南方人參”。龍眼原產(chǎn)于中國和東南亞，在東南亞、南亞、澳大利亞和夏威夷等地均有較大規(guī)模的種植[1]。我國栽培龍眼的歷史可追溯到2000多年以前，種植龍眼的?。▍^(qū)）包括廣東、廣西、福建、四川、云南和海南，但主產(chǎn)區(qū)在廣東、廣西和福建3個?。▍^(qū)）[2]。龍眼合子胚的生長發(fā)育狀況與其產(chǎn)量、種子大小、果實品質(zhì)等生產(chǎn)性狀息息相關(guān)，由于龍眼樹體高大，合子胚被果實胚囊包裹在中間，并且在子葉胚形成前合子胚極其細小，無法實時觀測合子胚的發(fā)育狀況，導致龍眼合子胚發(fā)育中期階段之前的材料取材困難[3]。同時，龍眼具有童期長、遺傳背景復雜、高度雜合的特點，極大限制了分子生物學在龍眼合子胚胚胎發(fā)育研究上的應用。植物體細胞胚胎（體胚）發(fā)生過程和合子胚胚胎發(fā)生過程的發(fā)育階段高度相似[4-5]，體胚發(fā)生是植物胚胎發(fā)生特別是胚胎發(fā)育早期分子調(diào)控機制研究的模式系統(tǒng)[6]。賴鐘雄等[7-8]建立的龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)具有高度同步、高頻率發(fā)生和再生能力強等特點，是研究木本植物胚胎發(fā)生的優(yōu)良實驗系統(tǒng)。20多年來，福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所在龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)研究的基礎上，對其分子調(diào)控機制進行了大量研究，包括龍眼體胚發(fā)生相關(guān)基因克隆、全基因組鑒定，體胚發(fā)生相關(guān)基因表達模式與功能研究，蛋白質(zhì)組學分析，全轉(zhuǎn)錄組測序分析，DNA甲基化研究，龍眼體胚發(fā)生過程lncRNA、microRNA、miPEP、cirRNA研究，龍眼體胚遺傳轉(zhuǎn)化研究等。Lin等[9]于2017年首次完成了龍眼全基因組測序，建立了無患子科植物的第一個全基因組數(shù)據(jù)庫，為研究龍眼體胚發(fā)生的分子調(diào)控機制提供完整的基因組信息。本文就龍眼體胚發(fā)生各方面的研究進展進行綜述。

1? 龍眼體胚發(fā)生研究進展

1.1? 龍眼胚性愈傷組織誘導與離體保存

在20世紀80年代初，研究人員就已經(jīng)開始進行龍眼體胚發(fā)生與植株再生等方面的研究。魏文雄等[10]以‘東壁和‘紅核子幼胚子葉為外植體首次誘導出愈傷組織，但僅在少數(shù)愈傷組織中產(chǎn)生胚性細胞，胚性細胞通過體胚發(fā)生途徑獲得完整植株;楊永青等[11]以‘東壁花藥為材料誘導胚性愈傷組織（embryogenic callus， EC），由EC分化的胚狀體再萌發(fā)成正?；ǚ壑仓?，經(jīng)根尖細胞鏡檢獲得單倍體龍眼植株（n=15）;周麗儂等[12]以無菌初生幼苗和自然萌發(fā)實生苗的不同組織部位為外植體，誘導獲得愈傷組織，但只有莖段誘導的愈傷組織可分化成芽，以及側(cè)芽和頂芽誘導的部分愈傷組織可分化成根;楊永青等[13]從焦核龍眼幼胚的離體培養(yǎng)中獲得胚狀體，通過體胚發(fā)生途徑獲得再生植株，實現(xiàn)焦核龍眼的胚胎挽救。此外，Litz[14]從樹齡超過30年的龍眼樹幼葉離體培養(yǎng)中獲得EC，經(jīng)體胚發(fā)生途徑獲得再生植株。因此，已經(jīng)成功從龍眼的子葉幼胚、花藥和葉片等組織部位誘導出龍眼EC，并經(jīng)體胚發(fā)生途徑獲得了再生植株，但部分胚性愈傷組織的穩(wěn)定性和體胚發(fā)生能力較差，甚至出現(xiàn)畸形胚，體胚發(fā)生頻率較低、數(shù)量較少，制約了龍眼體胚發(fā)生過程的生理生化及分子生物學等系統(tǒng)研究。

20世紀90年代初，賴鐘雄等[1， 8]以‘紅核子‘油譚本‘東壁‘十二月龍眼‘九月烏等龍眼未成熟果幼胚和‘東壁等龍眼的花藥為外植體，誘導出CI類型，CIIa、CIIb類型，CIII類型的愈傷組織，CIIa、CIIb類型愈傷組織經(jīng)4～5次繼代培養(yǎng)也可選擇出松散型的CIII型愈傷組織，CIIa、CIIb類型和CIII類型的愈傷組織體胚發(fā)生能力極強，經(jīng)過1個月左右的培養(yǎng)，每克鮮樣可分化出約1萬個胚狀體;以MS為基本培養(yǎng)基分別添加1.0 mg/L 2，4-D與1.0 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L KT、5.0 mg/L AgNO3對松散型胚性愈傷組織進行交替培養(yǎng)，可達到長期繼代保存松散型胚性愈傷組織的目的。葉煒等[15]參照此法，成功從51份龍眼種質(zhì)中誘導獲得胚性愈傷組織，并進行長期繼代保存。林秀蓮等[16]通過對離體保存的龍眼EC及其體胚發(fā)生過程染色體數(shù)目變異的研究，發(fā)現(xiàn)二倍體龍眼離體培養(yǎng)物中存在單倍體、三倍體、四倍體、非整倍體等廣泛的變異，這種變異現(xiàn)象從EC誘導開始就存在，并且變異率會隨離體培養(yǎng)時間的增加而升高，但最終趨于穩(wěn)定。

1.2? 龍眼高頻體胚發(fā)生及植株再生

賴鐘雄等[7]在獲得3種類型胚性愈傷組織的基礎上，明確了愈傷組織的類型、蔗糖濃度和光照條件是龍眼體胚發(fā)生過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，成功建立了龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)。賴鐘雄等[17]從不同龍眼品種外植體中誘導篩選的CIII型龍眼EC通過液體培養(yǎng)方式都能在2周左右建立胚性懸浮細胞系，采用分別附加AgNO3和肌醇的液體培養(yǎng)基交替培養(yǎng)及固體-液體輪回培養(yǎng)的方式實現(xiàn)了胚性懸浮細胞系的長期保持，胚性懸浮細胞轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基或在液體淺層培養(yǎng)均可獲得大量胚狀體，固體培養(yǎng)基上的胚狀體大小不一致，液體淺層培養(yǎng)的大小比較一致，體胚成熟后獲得再生植株。龍眼松散型胚性愈傷組織經(jīng)過分離獲得單細胞懸浮細胞系，龍眼的單細胞采用液體淺層培養(yǎng)方式，先形成多細胞團，再發(fā)育形成早期球形原胚結(jié)構(gòu)、球形胚結(jié)構(gòu)和子葉形胚結(jié)構(gòu)，最終獲得再生植株[18]。此外，龍眼胚性培養(yǎng)細胞及胚性懸浮細胞可獲得高產(chǎn)和高活力的原生質(zhì)體，與懸浮單細胞培養(yǎng)類似，龍眼原生質(zhì)體通過體胚發(fā)生途徑形成再生植株[19]。賴鐘雄等[20]采用電融合方法將龍眼和荔枝的原生質(zhì)體進行融合，融合率超過20%，融合產(chǎn)物經(jīng)初步培養(yǎng)形成多細胞團。黃淺等[21]進行荔枝龍眼原生質(zhì)體的電融合研究，融合率高達30%以上，建立了荔枝和龍眼原生質(zhì)體的電融合技術(shù)體系，融合產(chǎn)物經(jīng)初步培養(yǎng)形成多細胞團。龍眼這種極強體胚發(fā)生和植株再生能力在木本植物中是十分罕見的，這種優(yōu)良的體胚發(fā)生體系可作為研究植物體胚發(fā)生尤其是木本植物體胚發(fā)生的模式實驗系統(tǒng)。

1.3? 龍眼體胚發(fā)生同步化調(diào)控與組織形態(tài)學觀察

體胚發(fā)生的同步化調(diào)控是建立龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在龍眼EC誘導及高頻體胚發(fā)生的基礎上，陳春玲等[22]進行了龍眼體胚發(fā)生的同步化調(diào)控研究，發(fā)現(xiàn)龍眼EC在分別添加0.5、0.3、0.1、0 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基（蔗糖2%）中培養(yǎng)，可分別獲得高度同步化的不完全胚性緊實結(jié)構(gòu)、胚性緊實結(jié)構(gòu)、球形胚和非胚性愈傷組織，將龍眼EC轉(zhuǎn)移至MS基本培養(yǎng)基（蔗糖5%）上培養(yǎng)可獲得高度同步的早期子葉形胚和成熟子葉胚，組織形態(tài)學研究表明龍眼體胚發(fā)生主要是單細胞內(nèi)起源。王鳳華等[23]將球形胚接種于蔗糖含量為2%的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在培養(yǎng)至第8～9天和第10～12天分別獲得大量同步化的心形胚和魚雷形胚;將龍眼EC接種于蔗糖含量為2%的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d獲得大量同步化的子葉形胚，子葉形胚接種于蔗糖含量為5%的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)約75 d可獲得成熟體胚。方智振等[24]在獲得高度同步化的球形胚（0.1 mg/L 2，4-D）基礎上，將球形胚接種于添加0.07、0.05、0.06、0 mg/L 2，4-D的MS基本培養(yǎng)基中，分別獲得同步化的心形胚、魚雷形胚和子葉形胚。因此，2，4-D濃度、蔗糖濃度以及培養(yǎng)時間對龍眼體胚同步化調(diào)控具有重要的影響，通過對這3個因子的調(diào)控可獲得同步化的各個發(fā)育階段胚性培養(yǎng)物，為龍眼體胚發(fā)生過程的生理生化變化與代謝物積累、全轉(zhuǎn)錄組學分析、蛋白質(zhì)組學分析、體胚發(fā)生相關(guān)基因的表達調(diào)控和功能分析等研究奠定基礎。

2? 龍眼體胚發(fā)生過程生理生化變化與代謝物積累

植物激素的誘導與調(diào)節(jié)是體胚發(fā)生和發(fā)育的關(guān)鍵因素，而內(nèi)源激素的代謝與動態(tài)平衡對細胞分化至關(guān)重要。賴鐘雄等[3]的研究表明，龍眼胚性愈傷組織中內(nèi)源激素含量高于非胚性愈傷組織內(nèi)源激素的含量，從龍眼胚性愈傷組織階段至子葉形胚階段內(nèi)源IAA含量維持在較高水平，且遠高于非胚性愈傷組織階段，而在成熟子葉胚階段則急劇下降;在非胚性愈傷組織階段的內(nèi)源GA3含量較高，隨著體胚的進一步發(fā)育，內(nèi)源GA3的含量逐漸下降;與內(nèi)源IAA和GA3相比內(nèi)源ABA的含量總體較低，在體胚發(fā)生過程ABA含量從球形胚階段開始相對較高，內(nèi)源玉米素含量的變化趨勢與IAA相似，只是在成熟子葉形胚階段其含量仍維持在較高水平;除GA3外，內(nèi)源激素在胚性愈傷階段II和球形胚階段的含量較高，呈現(xiàn)類“M”的變化趨勢。龍眼體胚發(fā)生過程內(nèi)源多胺含量的研究表明，內(nèi)源多胺與內(nèi)源激素含量的變化趨勢相似，都呈現(xiàn)類“M”的變化趨勢[25]。通過對龍眼體胚發(fā)生過程的內(nèi)源激素和多胺的研究表明，胚性愈傷階段II和球形胚是其生理生化變化的轉(zhuǎn)折階段，雖然胚性愈傷階段I和階段II在組織形態(tài)學上沒有差別，但生理生化上已經(jīng)發(fā)生明顯的變化[3]。此外，高濃度蔗糖、光照條件、滲透劑聚乙二醇（PEG）、椰乳和脫落酸等培養(yǎng)因子對龍眼體胚成熟過程中的可溶性糖、淀粉含量也具有明顯的調(diào)控作用[26]。陳春玲[27]的研究結(jié)果表明，酯酶、過氧化物酶和淀粉酶同工酶酶譜在龍眼體胚發(fā)生過程中的規(guī)律性變化，反應出龍眼體胚發(fā)生過程各個階段遺傳信息表達的選擇性和順序性。乙醇脫氫酶的含量在龍眼體胚發(fā)生過程中逐漸降低[28]，而抗壞血酸過氧化物酶同工酶含量在胚性愈傷組織、球形胚、子葉形胚階段逐漸遞增[29]。陳義挺等[30]研究表明，隨著龍眼體胚早期發(fā)生（松散型胚性愈傷組織、胚性愈傷II、不完全胚性緊實結(jié)構(gòu)、胚性緊實結(jié)構(gòu)、球形胚）過氧化物酶（POD）活性呈下降趨勢，低溫或高溫處理下POD酶活性顯著高于對照，高溫或低溫均可明顯影響POD同工酶譜帶的出現(xiàn)和表達，POD酶活性及其同工酶譜的規(guī)律性變化可能與龍眼體胚發(fā)生早期的細胞分化和體胚發(fā)育維持具有密切的關(guān)系。

光調(diào)控是一種改變植物細胞功能性代謝產(chǎn)物合成的重要方法，采用不同光質(zhì)處理龍眼EC結(jié)果表明，藍光和白光可以促進龍眼EC中多糖、生物素、生物堿和類黃酮的積累，其中藍光的效果最明顯;與白光和黑暗處理相比，藍光處理下龍眼EC中超氧化物歧化酶、過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性和過氧化氫酶含量顯著升高，說明光照能激活龍眼EC中的抗氧化系統(tǒng)[31]。李漢生等[32]采用生物反應器放大培養(yǎng)龍眼懸浮細胞，

研究藍光和黑暗培養(yǎng)下類黃酮的積累，發(fā)現(xiàn)藍光培養(yǎng)9 d后類黃酮含量增長了0.77 mg/g。廖斌等[33]研究不同光照條件對生物反應器中龍眼懸浮細胞生長及柯里拉京代謝合成的影響，結(jié)果表明黑暗條件利于龍眼胚性懸浮細胞生長及細胞內(nèi)柯里拉京的積累，培養(yǎng)液pH和溶氧是龍眼胚性懸浮細胞生長及柯里拉京合成的重要調(diào)控因子。崔彤彤[34]研究發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)時間、溫度和水楊酸（SA）濃度及SA的添加時間對龍眼EC中類黃酮和類胡蘿卜素積累具有顯著的影響，且在不同溫度和SA濃度下培養(yǎng)第30天時龍眼EC中SOD、CAT、POD細胞保護酶活性也發(fā)生顯著變化。研究表明，基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑可影響龍眼EC中類黃酮和類胡蘿卜素的積累[35];真菌誘導子種類、誘導時間和濃度影響龍眼EC中多糖的積累，100 mg/L龍眼擬莖點霉誘導子誘導15 d時龍眼EC多糖含量最高，比對照提高了61.34%[36];此外，真菌誘導子的種類、誘導時間和濃度影響龍眼EC中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧的含量[37]。因此，在龍眼體胚不同發(fā)育階段、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基成分、光照條件、植物生長調(diào)節(jié)劑和真菌誘導子等培養(yǎng)條件與龍眼胚性細胞內(nèi)代謝物質(zhì)的積累具有密切的關(guān)系。

3? 龍眼體胚發(fā)生分子調(diào)控機制

3.1? 龍眼體胚發(fā)生蛋白質(zhì)組學研究

陳春玲等[38]采用IEF和SDS-PAGE技術(shù)分析NEC、EC-Ⅰ、EC-Ⅱ、ICpEC、CpEC、GE、pro-CE、CE 8個階段的差異表達蛋白，在等電點pI差異上，EC、pro-CE階段分別檢測出pI 5.1、pI 5.4和pI 4.4特異蛋白;在蛋白質(zhì)相對分子量差異上，8個階段的蛋白質(zhì)相對分子量分布在6～110 kDa之間，13.9 kDa蛋白是NEC階段的特異蛋白，分子量為6.2 kDa和6.9 kDa的蛋白質(zhì)為CE階段新發(fā)現(xiàn)的特異表達蛋白。參照此法，王鳳華[39]研究了龍眼體胚發(fā)生過程的差異表達蛋白，在胚性愈傷組織、球形胚、魚雷形胚、子葉形胚、成熟胚階段分別檢測出1、2、6、4、4個階段特異表達蛋白。李冬梅[26]研究表明，龍眼體胚成熟過程和每個成熟階段均能檢測到特異表達蛋白，龍眼體胚成熟過程蛋白質(zhì)合成在黑暗+低糖+ABA共同培養(yǎng)條件下最活躍。安娜等[40]研究表明，龍眼體胚發(fā)生過程pI 4～5的酸性蛋白逐漸減少，而pI 5～6的酸性蛋白逐漸增加，在體胚成熟階段，分子量大的蛋白質(zhì)數(shù)量明顯減少，而分子量小的蛋白質(zhì)數(shù)量逐漸增多。郭玉瓊[41]分析龍眼球形胚低溫預培養(yǎng)過程的蛋白質(zhì)，鑒定了特異表達蛋白LLT1、LLT2、LLT3、LLT4;何園[42]在龍眼子葉胚成熟過程中鑒定出29個差異表達蛋白，涉及蛋白質(zhì)合成、能量和糖類代謝、脅迫應答和抗氧化等過程的相關(guān)蛋白;賴呈純[43]進行龍眼體胚發(fā)生早期蛋白質(zhì)組學研究，獲得148個差異表達的蛋白質(zhì)，最終從118個差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定中鑒定出45個差異表達蛋白質(zhì);方智振[44]在龍眼體胚發(fā)生中期蛋白質(zhì)組學研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的種類隨著龍眼體胚的發(fā)育進程逐漸減少，從76個差異表達蛋白質(zhì)中選取66個進行質(zhì)譜分析，共鑒定出35個差異表達蛋白質(zhì)，其中51%的蛋白質(zhì)都涉及代謝途徑，說明龍眼體胚發(fā)生中期蛋白質(zhì)的代謝比較活躍;隨著體細胞胚的發(fā)育，細胞不斷分化，體細胞胚中表達的蛋白種類減少，氧化脅迫相關(guān)蛋白、RAN2和GTPase ObgE與龍眼體細胞胚發(fā)生的調(diào)控有關(guān)[45];李然等[46]研究表明，龍眼EC生長過程蛋白質(zhì)點數(shù)總體升高，pI介于4～7，蛋白分子量介于14～97 kDa，30～66 kDa的蛋白質(zhì)在龍眼EC生長過程具有相對較高的表達量。因此，基于雙向電泳技術(shù)的蛋白質(zhì)組學研究，揭示了龍眼體胚發(fā)生過程的差異表達蛋白質(zhì)，共鑒定了162個差異表達蛋白質(zhì)，分析了差異表達蛋白所涉及的相關(guān)代謝過程，說明差異表達蛋白參與龍眼體胚發(fā)生過程的調(diào)控。

雖然前期研究已經(jīng)鑒定了部分與體胚發(fā)生相關(guān)的蛋白，揭示了它們在龍眼體胚發(fā)生過程的潛在調(diào)控作用，但所鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量有限，無法全面挖掘差異表達蛋白在龍眼體胚發(fā)生過程的調(diào)控網(wǎng)絡。因此，陳裕坤[47]進行了iTRAQ標記的龍眼體胚發(fā)生早期蛋白質(zhì)組學測序分析，在NEC、EC、ICpEC、GE 4個階段中共鑒定了5035個蛋白質(zhì)，代謝途徑與次級代謝物的合成是所鑒定蛋白質(zhì)主要富集的KEGG代謝通路;在NEC與EC、ICpEC、GE成對比較中分別鑒定出82、78、103個差異表達蛋白質(zhì)，在EC與ICpEC、GE成對比較中分別鑒定了73、160個差異表達蛋白質(zhì)，在ICpEC_與GE成對比較中鑒定了116個差異表達蛋白質(zhì);龍眼體胚發(fā)生早期階段差異表達的LEC1-like、幾丁質(zhì)酶CHI5/-4、阿拉伯半乳聚糖AGP8和糖蛋白EP1等蛋白可能對體胚發(fā)育早期具有調(diào)控作用;同時，糖類與能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)在龍眼體胚發(fā)生早期的差異性表達極為顯著，糖酵解、酒精發(fā)酵、戊糖磷酸途徑、三羧酸循環(huán)的差異表達蛋白質(zhì)在球形胚階段基本都表現(xiàn)出顯著上調(diào)的趨勢，糖類與能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)可能參與龍眼體胚發(fā)生早期的調(diào)控。生長素、脫落酸和赤霉素等激素相關(guān)蛋白，脅迫應答蛋白CAT、POD、APX、GPX等，脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝、以及細胞骨架結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白在龍眼體胚發(fā)生早期均發(fā)生顯著的差異表達，可能與龍眼體胚發(fā)生和體胚早期的發(fā)育有著密切的關(guān)系?；趇TRAQ技術(shù)的龍眼體胚發(fā)生早期蛋白質(zhì)組高能量測序分析，鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)量遠高于之前的研究，也能更精確地獲得不同發(fā)育階段間蛋白質(zhì)的變化，從蛋白質(zhì)水平解析龍眼體胚發(fā)生早期的分子調(diào)控機制。

3.2? 龍眼體胚發(fā)生全轉(zhuǎn)錄組學研究

Lai等[48]對龍眼胚性愈傷組織進行Solexa測序分析，在龍眼胚性愈傷組織中共有17 306個基因，共涉及199個KEGG途徑，其中基因序列長度高于1000 bp的體胚發(fā)生相關(guān)基因有328個，對所篩選的23個基因在體胚發(fā)生過程的表達分析表明，候選基因在龍眼體胚發(fā)生過程差異表達，差異表達基因是龍眼體胚發(fā)生的潛在調(diào)控因子。雖然從龍眼胚性愈傷組織轉(zhuǎn)錄組測序中挖掘了一些體胚發(fā)生相關(guān)基因，但未能闡明體胚發(fā)生過程差異表達或發(fā)育階段特異表達基因及其代謝途徑等調(diào)控作用，龍眼體胚發(fā)生過程分子調(diào)控網(wǎng)絡還有待構(gòu)建。因此，Chen等[49]開展了龍眼體胚發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄組分析，獲得大量差異表達基因，初步構(gòu)建了龍眼體胚發(fā)生早期的分子調(diào)控網(wǎng)絡;轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，生長素和細胞分裂素等激素信號途徑在龍眼體胚發(fā)生過程的重要調(diào)控作用，類黃酮主要在非胚性愈傷組織中富集，而脂肪酸則主要富集在體胚發(fā)生早期，胚性愈傷組織中表達最高，隨后略有降低;LTP、CHI、GLP、AGP、EP1等胞外蛋白編碼基因、DNA復制和細胞周期相關(guān)基因在龍眼體胚發(fā)生早期差異表達顯著，可能與龍眼體胚發(fā)生具有密切的關(guān)系;將龍眼體胚發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄組與龍眼9個組織部位轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)LEC1、L1L、PDF1.3、GH3.6、AGL80、PIN1、BBM、WOX9、WOX2、ABI3、FUS3、LEC2等27個基因僅在EC、ICpEC、GE階段表達量極高，在NEC階段表達量極低或不表達，可作為龍眼體胚發(fā)生早期的分子標記基因;此外，還鑒定了LEA5、CNOT3、DC2.15、PR1-1、NsLTP2等28個在NEC階段特異表達的分子標記基因，這些發(fā)育階段特異表達的分子標記基因可能是龍眼體胚發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。在龍眼EC和體胚發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄組測序基礎上，該實驗室還開展了不同光質(zhì)、5-氮胞苷（5-azac）處理的轉(zhuǎn)錄組測序分析。Li等[31]研究了藍光、白光處理下龍眼胚性愈傷組織中功能性代謝產(chǎn)物積累的轉(zhuǎn)錄組學，初步構(gòu)建了影響龍眼功能性代謝產(chǎn)物的藍光信號網(wǎng)絡：在黑暗+藍光和黑暗+白光中分別鑒定出4463和1639個差異表達基因，基于次級代謝圖譜分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要富集在“莽草酸途徑”“苯丙烷類化合物途徑”“單酚途徑”“木質(zhì)素和木脂素類途徑”“類黃酮途徑”;差異基因成對比較也說明了藍光比白光更顯著地影響龍眼EC代謝途徑和其它過程;同時，PIF4、AFR、MYC2是龍眼EC中受光照影響最為顯著的轉(zhuǎn)錄因子。陳榮珠[50]研究了5-氮胞苷處理的龍眼EC轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得1617個差異表達基因，其主要富集在植物病原互作、植物激素信號轉(zhuǎn)導、植物MAPK信號通路、淀粉和糖代謝及丁酸鹽代謝等通路;5-氮胞苷處理可降低龍眼的DNA甲基化水平，促進龍眼體胚發(fā)生相關(guān)基因（FUS3、ABI3、FT1、GABA-T3、CAS、GLP等）和AGO4基因的表達，從而促進龍眼早期體胚發(fā)生。

Lin等[51]進行了龍眼體胚發(fā)生過程miRNA組學分析，鑒定了643個保守miRNA和29個新的miRNA，從其中272個miRNA預測出2063個靶基因，龍眼體胚發(fā)生過程qRT-PCR表明dlo- miR156家族及dlo-miR166c*與龍眼體胚早期的發(fā)育關(guān)系密切，dlo-miR26、dlo-miR160a、dlo-miR159等可能參與心形胚和魚雷形胚的形態(tài)建成，dlo-miR4a、dlo-miR24、dlo-miR167a、dlo-miR168a*等小RNA可能參與子葉胚發(fā)育過程的調(diào)控，其中dlo-miR167a、dlo-miR808、dlo-miR5077可能是胚胎成熟所必需的基因。Xu等[52]對龍眼體胚發(fā)生早期進行miRNA測序，從106個不同的miRNA家族和1087個新miRNA中共鑒定出289個已知miRNA，這些已知的miRNA集中在GE階段表達;許多miRNA在EC、ICpEC、GE階段大量且特異性地表達，一些miRNA及其預測的靶基因主要富集在木質(zhì)素代謝途徑;通過RNA連接酶介導的cDNA末端快速擴增進一步明確了dlo-miR166a- 3p和DlHD-zip8、dlo-miR397a和DlLAC7、dlo-miR408-3p和DlLAC12之間存在相互調(diào)控的關(guān)系。Li等[53]對不同光質(zhì)處理的龍眼EC進行miRNA測序分析，從30個miRNA家族中鑒定111個miRNA，miRNA靶基因KEGG富集分析表明，光對龍眼功能性代謝產(chǎn)物的合成涉及植物激素信號轉(zhuǎn)導、MAPK信號轉(zhuǎn)導等多種響應途徑;此外，miR171D_1、miR394a、miR396b-5p、miR5139可能參與藍光處理下胚性愈傷組織中功能性代謝產(chǎn)物的代謝過程，miR171D_1、miR319e、miR394a、miR395b_2、miR396e可能參與白光處理下胚性愈傷組織中功能性代謝產(chǎn)物的代謝過程;miR171f_3、miR390e、miR396b-5p通過分別靶定DELLA、BRI1、EBF1/2與EIN3基因參與藍光信號途徑，進而調(diào)控龍眼胚性愈傷組織中功能代謝產(chǎn)物的累積。

長鏈非編碼RNA（lncRNAs）參與可變剪切、轉(zhuǎn)錄干擾、DNA甲基化調(diào)控和蛋白修飾等過程，在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和表觀遺傳等水平上發(fā)揮重要的調(diào)控作用。為探究lncRNAs在龍眼體胚發(fā)生過程所發(fā)揮的調(diào)控作用，Chen等[54]開展了龍眼體胚發(fā)生早期lncRNA高通量測序分析，共鑒定6005個表達的lncRNA，其中4790個在3個階段均有表達，在EC、ICpEC、GE階段特異表達的lncRNA分別有160、154、376個，結(jié)合不同階段差異lncRNA成對比較，說明龍眼GE的形成可能需要大量的lncRNA來啟動;對體胚發(fā)生早期表達的6005個lncRNA進行注釋，1404個lncRNA屬于506個非編碼RNA家族、4682個lncRNA被預測為靶向蛋白編碼基因，其中靶基因包括順式調(diào)控靶基因5051個（5712對），反式調(diào)控靶基因1605個（3618對）;KEGG分析發(fā)現(xiàn)，龍眼體胚發(fā)生早期lncRNAs的差異表達靶基因主要參與“植物- 病原體互作”和“植物激素信號”通路中;在lncRNA-miRNA-mRNA關(guān)系預測中，40個lncRNA被預測為15個miRNA的內(nèi)源miRNA誘捕靶標（eTMs），7個lncRNA被鑒定為潛在的miRNA前體，并且通過miR172a、miR159a.1和miR398a的瞬時表達證實了lncRNA-miRNA- mRNA之間的調(diào)控關(guān)系;因此，lncRNA作為miRNA的eTMs可能是龍眼早期SE的重要調(diào)控機制。

3.3? 龍眼體胚發(fā)生過程DNA甲基化研究

植物體胚發(fā)生過程伴隨著DNA甲基化水平的變化，DNA甲基化水平對植物體胚發(fā)生過程具有重要的調(diào)控作用。研究表明，DNA甲基化水平影響植物的體胚發(fā)生，在柑橘中具體胚發(fā)生能力的愈傷組織比無體胚發(fā)生能力的愈傷組織的DNA甲基化水平更低[55]，刺五加中胚性愈傷組織比非胚性愈傷組織的DNA甲基化水平也更低[56]，蒺藜苜蓿中體胚發(fā)生依賴一定程度的DNA甲基化水平，去甲基化試劑5-氮胞苷處理會阻止其體細胞胚的產(chǎn)生從而影響植株的再生能力[57]。近年來，龍眼體胚發(fā)生過程DNA甲基化相關(guān)的研究得到了比較深入的研究。Argonaute蛋白（AGO）是miRNA加工合成途徑中的關(guān)鍵蛋白，參與介導DNA的甲基化過程。楊曼曼[58]從龍眼EC中克隆了AGO家族4個成員DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6的cDNA全長序列，結(jié)合其在龍眼體胚發(fā)生過程和不同組織部位中的表達模式分析，初步探究了AGO家族可能參與龍眼體胚發(fā)生過程及其它生長發(fā)育過程的調(diào)控[59-60]。陳榮珠[50]進行了龍眼AGO家族的10個成員的全基因組鑒定，分別分布于第1、4、8、10、12、13、14和15號染色體，并對DlAGO4[61]、DlAGO7、DlAGO10[62]和DlAGOMEL1進行克隆與表達模式分析、啟動子功能研究，說明其可能參與調(diào)控龍眼體胚發(fā)生過程;此外，5-azac結(jié)合2，4-D處理龍眼EC有利于球形胚的產(chǎn)生，低濃度5-azac處理促進DlAGO4的表達。5-azac處理龍眼EC的轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了龍眼DNA甲基化水平的降低促進體胚發(fā)生相關(guān)基因和DlAGO4的上調(diào)表達，從而促進龍眼體胚發(fā)生。陳曉慧[63]從龍眼EC中克隆lmiRNA介導甲基化通路中的關(guān)鍵因子Dicer-like（DCL）的4個成員DlDCL1-4及其啟動子，實時熒光定量分析表明，一定濃度5-azac處理后DlDCL3和DlDCL4的表達量下降，而DlDCL1在0.3 μmol/L 5-azac，DlDCL2在0.5 μmol/L 5-azac處理時表達量最大，說明DlDCLs不同成員均能響應5-azac處理[64-65]。白玉[66]從龍眼EC克隆lmiRNA介導甲基化通路中的關(guān)鍵因子DlDRM1[67]和DlDRM2的克隆與表達分析，推測龍眼愈傷非胚性與胚性的轉(zhuǎn)化可能與DlDRM1基因的表達有關(guān)，而DlDRM2在ICpEC中的調(diào)控作用最為顯著，5-azac可能通過促進DlDRM1表達，抑制DlDRM2的表達，從而參與龍眼體胚發(fā)生過程的調(diào)控。

Chen等[68]在龍眼基因組數(shù)據(jù)庫鑒定了龍眼DNA甲基化相關(guān)基因，利用全基因組亞硫酸氫鹽測序技術(shù)（BS-Seq）繪制龍眼EC、ICpE、GE 3個階段基因組中單堿基分辨率的胞嘧啶甲基化圖譜，顯示龍眼體胚發(fā)生早期中EC、ICpEC和GE整體5 mC水平分別為24.59%、19.65%和19.74%，表明龍眼體胚早期是一個DNA甲基化降低的過程，在ICpEC階段DNA甲基化水平最低，隨后在形成GE時甲基化水平又有所增加，說明細胞從無組織狀態(tài)的EC轉(zhuǎn)變呈有形態(tài)結(jié)構(gòu)的ICpEC過程中甲基化水平降低;龍眼體胚發(fā)生甲基化程度不同的主要原因是大量CHH位點甲基化的獲得或丟失造成的;對CHH-DMRs相關(guān)基因GO富集分析表明，DNA甲基化可能在影響體胚發(fā)生過程中的DNA整合、核酸結(jié)合、蛋白轉(zhuǎn)運等方面發(fā)揮著重要作用;此外，5-azac處理龍眼EC可促進其體胚發(fā)生。

3.4? 龍眼體胚發(fā)生相關(guān)基因克隆與表達分析、全基因組鑒定和功能研究

植物體胚發(fā)生和發(fā)育過程涉及大量特異基因的選擇性表達[6]。王鳳華等[69]采用DDRT法首次從龍眼體胚中分離獲得5條cDNA片段，實時熒光定量分析表明同甜椒和番茄APX同源的基因片段longan1在胚性愈傷組織和球形胚階段特異表達。隨后，研究人員進行了龍眼胚性培養(yǎng)物中體胚發(fā)生相關(guān)基因克隆及其表達分析的研究：如細胞周期調(diào)節(jié)基因CDC48[70];Adh、CAT、POD、APX、GPX等抗氧化相關(guān)基因，SOD家族20個成員及其中6個成員的啟動子[71]，谷胱甘肽代謝γ-ECS、GSHS、GR、GPX、GST基因[72];胚性相關(guān)基因SERK1、LEC1、AGL15、14-3-3、CHI-I、CHI-III及其啟動子[73]，WUS、CLV1、CLV2、CRN[74];激素代謝與信號轉(zhuǎn)導途徑TIR1、ABP1、ARF1、ACS、ACO、ETR1、ERS基因[75]，ARF家族7個成員[76]，生長素受體基因TIR1及其啟動子[77-78];能量代謝相關(guān)基因ATP β subunit、TPI[43];細胞程序性死亡相關(guān)基因CP、COX Vb和Caspase[79];WRKY家族10個成員[80]，NBS- LRR家族46個成員[81];DlRemorin1-5[82]、DlGRAS4和DlGRAS54[83]等體胚發(fā)生過程差異表達基因，以及43個開花時間相關(guān)基因[47];此外，方智振[44]克隆了Ran家族31條全長cDNA，并研究Ran的3'端轉(zhuǎn)錄多態(tài)性、可變剪接體及其在體胚發(fā)生過程的表達分析[84-85]，克隆了Ran3A、Ran3B啟動子[86];Tian等[87-88]研究了DlRan3A和DlRan3B表達模式及其啟動子的功能;Chen等[89]研究發(fā)現(xiàn)，種子特異表達基因DlMFT在龍眼體胚發(fā)生和合子胚發(fā)育過程中表達量顯著上升，可能具有促進胚胎發(fā)育的作用，而在種子發(fā)育過程中表達量顯著下降可能具有抑制種子萌發(fā)的功能。Lin等[90]對龍眼體胚發(fā)生過程及不同培養(yǎng)條件下多內(nèi)參基因的篩選，為龍眼體胚發(fā)生過程、不同組織部位、外源激素處理等條件下基因的表達調(diào)控模式分析和基因功能研究奠定了基礎。

自2017年首次完成龍眼全基因組測序[9]以來，龍眼基因家族的全基因組鑒定與表達分析得到了大量的研究，如ERF基因家族108個成員[91]、AP2/ERF超家族125個成員[92]、Sm基因家族29個成員[93]、Hsf基因家族[94]、GRF基因家族[95]、龍眼HDAC基因家族[96]、BRI家族[97]、漆酶家族成員[98]、Aquaporin基因家族[99]、纖維素合成酶CESA基因家族[100]、SDG基因家族[101]、RNA甲基化相關(guān)基因[102]、類受體蛋白激酶CRK家族[103]、MSIL基因家族[104]、4CL基因家族[105]、HD-Zip基因家族[106]等?；邶堁刍蚪M數(shù)據(jù)庫，龍眼基因家族成員的鑒定及其表達分析得到了廣泛的研究，完善了龍眼體胚發(fā)生的分子調(diào)控網(wǎng)絡，為龍眼體胚發(fā)生相關(guān)基因的功能研究奠定了基礎。

林玉玲[107]研究了龍眼體胚發(fā)生過程miRNA的表達調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)在體胚發(fā)生過程差異表達的miRNA可能通過與靶基因SOD家族的調(diào)控作用，從而影響龍眼體胚發(fā)生過程。Lin等[108]進行了龍眼體胚發(fā)生過程miRNA內(nèi)參基因的篩選，為龍眼體胚發(fā)生過程miRNA的表達調(diào)控機制及其功能研究奠定基礎。王亞婷[109]克隆dlo- miR156a-1、dlo-miR156a-2、dlo-miR166a、dlo- miR397a初級體及其靶基因laccase、β-tubulin，分析dlo-miR156a、dlo-miR166a、dlo-miR397a及靶基因β-tubulin表達模式。林麗霞[76]研究表明dlo-miR160負調(diào)控ARF10、ARF16、ARF17，dlo-miR167負調(diào)控ARF6和ARF8，dlo-miR390負調(diào)控TAS3，TAS3負調(diào)控ARF3、ARF4。Lin等[110]研究表明dlo-miR160a、dlo-miR160a、dlo-miR160d分別在魚雷型胚、球形胚和子葉形胚階段表達量出現(xiàn)峰值，可能對龍眼體胚發(fā)生中期和晚期階段具有調(diào)控作用;eTM-miR160-ARF10/16/17在體胚發(fā)生過程中起潛在調(diào)控作用，所鑒定的4個miR160的eTM，有2個對miR160a與靶基因的結(jié)合可能具有破壞作用，并參與生長素和脫落酸信號轉(zhuǎn)導途徑。Lin等[111]研究了eTM-miR167- ARF6/8在龍眼體胚發(fā)生過程的功能，所鑒定的2個miR167的eTM在球形胚階段表達量最大，但在不完全胚性緊實結(jié)構(gòu)和魚雷型胚階段幾乎不表達;龍眼體胚發(fā)生后期，eTM可能通過裂解靶基因ARF8從而對dlo-miR167的表達起負調(diào)控作用。TIR1與dlo-miR393互作關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，dlo- miR393可能通過抑制TIR1-3的轉(zhuǎn)錄進而影響龍眼體胚發(fā)生過程[78]。同時，研究人員對龍眼microRNA分子特性及其表達模式進行了分析，如miR403[112]、miR395[113]、miR166家族成員[114]、miR397家族成員[115]、miR159家族成員[116]、miR171家族成員[117]、miR172家族成員[118]等;張清林等[119]克隆了龍眼體胚發(fā)生早期miR166的初級體并進行表達分析;蘇立遙等研究了miR403及其候選靶標對外源激素的響應模式以及在龍眼體胚中的表達模式[120]、eTM和microRNA319及其調(diào)控靶標在龍眼體胚發(fā)生早期的表達模式[121]。此外，Zhang等[122]研究了龍眼miR166的結(jié)構(gòu)和龍眼體胚發(fā)生過程的表達模式及功能，發(fā)現(xiàn)miR166與ATHB15在龍眼體胚發(fā)生早期呈負調(diào)控關(guān)系，高水平表達miR166a.2可能有利于維持疏松的龍眼愈傷組織，而高水平表達ATHB15有利于球形胚的形成。

李漢生[123]在龍眼EC過表達和抑制表達miR390e，發(fā)現(xiàn)miR390e能夠剪切DlBRI1-3從而抑制DlBRI1-3的轉(zhuǎn)錄，影響龍眼功能性代謝產(chǎn)物的合成。陳裕坤[47]將DlMFT、DlTFL1、DlSHR異源表達于本氏煙，發(fā)現(xiàn)龍眼DlMFT能抑制種子的萌發(fā)但不影響植物的開花時間，龍眼DlTFL1具有調(diào)控植物開花時間的功能;DlSHR不僅影響轉(zhuǎn)基因植株的根系輻射狀分布，還會影響植物的生長發(fā)育過程，如出現(xiàn)生長較慢、開花推遲、根少且粗大、根光滑幾乎無毛、葉和莖部出現(xiàn)一定程度的扭曲、葉表皮毛粗大等表型;qRT-PCR表明過表達DlSHR植株中根輻射狀基因SCR及赤霉素相關(guān)的GAI基因表達極顯著增加，DlSHR可能通過控制SCR和GAI等下游基因的表達影響根系的結(jié)構(gòu)及葉片形態(tài)。

4? 龍眼胚性愈傷組織受體系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化研究

龍眼遺傳轉(zhuǎn)化研究已經(jīng)開展了近20年，但相關(guān)研究進展緩慢。陳裕坤等[124]和田奇琳[125]采用根癌農(nóng)桿菌侵染龍眼實生幼苗去頂和去頂芽部位獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。但是，以龍眼胚性愈傷組織為受體材料的轉(zhuǎn)基因研究目前還未能成功獲得完整的轉(zhuǎn)基因龍眼植株;曾黎輝[126]利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染龍眼1月齡成熟胚和無菌初生苗，誘導出毛狀根后再培養(yǎng)得到3株轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)基因植株的表型出現(xiàn)異常。通過組織、細胞形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，龍眼胚性愈傷組織的體胚發(fā)生主要為單細胞內(nèi)起源，這可能造成外源基因轉(zhuǎn)化至胚性細胞中的效率較低[22]。因此，很有必要對龍眼體胚不同發(fā)育階段的受體材料進行篩選，并對其遺傳轉(zhuǎn)化方法進行優(yōu)化。賴鐘雄[127]采用基因槍轉(zhuǎn)化法將PBI121質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至龍眼胚性細胞中，獲得Kan抗性細胞，經(jīng)GUS檢測表明gus基因已經(jīng)整合至龍眼胚性愈傷組織中，抗性細胞接種至分化培養(yǎng)基中獲得了胚狀體。張妙霞[128]采用根癌農(nóng)桿菌介導法將PEAS基因?qū)臊堁叟咝杂鷤M織中，獲得5個龍眼抗性細胞系。鄭啟發(fā)等[129]用金剛沙對液體懸浮培養(yǎng)的胚性愈傷組織進行創(chuàng)傷，結(jié)合根癌農(nóng)桿菌侵染法，將含有AP1和POD基因的質(zhì)粒導入懸浮培養(yǎng)系細胞中，最終獲得轉(zhuǎn)化AP1和POD基因的陽性龍眼胚狀體。徐清鋒[130]采用根癌農(nóng)桿菌介導法將ACS反義基因轉(zhuǎn)化龍眼胚性愈傷組織，經(jīng)GUS染色及PCR檢測獲得陽性轉(zhuǎn)基因愈傷組織。曾麗蘭[131]利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將龍眼FSD-pro4轉(zhuǎn)化至龍眼胚性愈傷組織中，經(jīng)過抗性篩選及PCR鑒定獲得陽性轉(zhuǎn)基因愈傷組織。張冬敏[132]利用根癌農(nóng)桿菌侵染法，將DlWUS瞬時過表達于龍眼EC，并初步驗證了龍眼EC過表達DlWUS抑制DlCLV1、DlCLV2、DlCRN的表達。賴瑞聯(lián)[133]借助脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑成功將miR393- agomir及其高效阻斷劑miR393-antagomir轉(zhuǎn)化至龍眼胚性愈傷組織中，初步建立了外源miRNA轉(zhuǎn)化龍眼胚性愈傷組織的高效體系。因此，已初步建立起以龍眼胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法，但其轉(zhuǎn)化效率、轉(zhuǎn)基因細胞系的體胚發(fā)生和植株再生能力等還存在一定的問題，今后在轉(zhuǎn)基因方法和轉(zhuǎn)基因體系優(yōu)化方面還有待深入研究。

5? 展望

龍眼體胚發(fā)生不僅是植株體外再生的重要途徑之一，還是研究龍眼分子生物學的優(yōu)良體系，為龍眼分子生物學研究奠定基礎和提供良好平臺。龍眼體胚發(fā)生過程的生理生化變化進一步明確了內(nèi)源激素代謝與動態(tài)平衡對龍眼體胚發(fā)生具有重要的作用;研究結(jié)果已經(jīng)表明，不同的培養(yǎng)基成分、不同光質(zhì)、不同外源添加物和不同培養(yǎng)階段影響龍眼體胚中功能性代謝物的積累，借助生物反應器初步建立了龍眼胚性細胞的大量培養(yǎng)，將來可應用于龍眼功能性代謝物如龍眼多糖、類黃酮、生物堿等的規(guī)模生產(chǎn)。龍眼體胚發(fā)生早期和中期的蛋白質(zhì)組學、全轉(zhuǎn)錄組學和DNA甲基化研究，挖掘了大量體胚發(fā)生過程差異表達的蛋白質(zhì)和基因，從mRNA、miRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)和DNA甲基化水平分析了龍眼體胚發(fā)生的分子機制;破譯龍眼基因組為龍眼體胚發(fā)生的分子機制研究搭建了重要的基因組信息平臺，體胚發(fā)生相關(guān)基因克隆、基因家族的全基因組鑒定與表達分析，進一步豐富了龍眼體胚發(fā)生的分子機制。但龍眼體胚發(fā)生中期至體胚成熟期的分子調(diào)控網(wǎng)絡有待完善，龍眼體胚發(fā)生的表觀調(diào)控網(wǎng)絡有待于進一步解析，龍眼體胚發(fā)生過程的代謝組學、cirRNA、單細胞測序、空間轉(zhuǎn)錄組測序和染色體外環(huán)狀DNA（eccDNA）等研究還有待開展（單細胞測序、空間轉(zhuǎn)錄組測序等部分工作正在進行中）。龍眼體胚發(fā)生相關(guān)基因的功能研究目前還比較依賴于異源表達模式植物，在龍眼胚性愈傷組織上的轉(zhuǎn)化以瞬時表達為主，將來可通過優(yōu)化龍眼體胚轉(zhuǎn)化方法，將龍眼體胚發(fā)生過程顯著差異表達或階段特異性表達的基因轉(zhuǎn)化至胚性愈傷組織中，獲得過表達與突變體細胞系或株系，可進一步揭示體胚發(fā)生關(guān)鍵基因在龍眼體胚發(fā)生過程的功能及其調(diào)控機制。最近，我們實驗室采用PacBio Sequel又完成了‘紅核子龍眼基因組三代測序（待發(fā)表），基因組序列原始草圖長度0.49 Gb，初步組裝的ContigN50達到5.71 Mb，共327條Contigs。利用Hi-C技術(shù)進一步輔助基因組組裝至染色體水平，通過對Contigs進行排序，最終構(gòu)建成15條Superscaffolds（包含300條Contigs），總長0.45 Gbp，Contigs N50為4.4 Mb，Superscaffold N50為27.7 Mb，占原始基因組長度的91.69%;隨后對其全基因組構(gòu)建互作圖譜，符合互作規(guī)律，表明該物種Hi-C輔助組裝結(jié)果良好。同時，進一步利用Hi-C技術(shù)研究龍眼體胚發(fā)生早期染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在胚性愈傷組織（EC）分化發(fā)育成球形胚（GE）過程中，其三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了大規(guī)模重組;從EC分化到不完全胚性緊實結(jié)構(gòu)（ICpEC）過程，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加致密，B Compartment之間的互作增強，同時該區(qū)域的開放性增強，A Compartment染色質(zhì)間互作減弱。龍眼基因組三代測序提供了更加完整和全面的基因組信息，為進一步揭示龍眼體胚發(fā)生的分子機制提供了強有力的技術(shù)平臺，特別是龍眼體胚發(fā)生過程的Hi-C測序，揭示了龍眼體胚發(fā)生過程的基因組動態(tài)變化規(guī)律，對于揭示植物早期體胚發(fā)生的分子機制，提供了新的線索。

參考文獻

Lai Z X， Chen C L， Zeng L H， et al. Somatic embryogenesis in longan [Dimocarpus longan Lour.][M]//Jain S M， Gupta P K， Newton R J. Somatic embryogenesis in woody plants. Netherlands， Dordrecht： Springer， 2000， 6： 415-431.

Mei Z Q， Fu S Y， Yu H Q， et al. Genetic characterization and authentication of Dimocarpus longan Lour. using an improved RAPD technique[J]. Genetics and Molecular Research， 2014， 13（1）： 1447.

賴鐘雄， 陳春玲. 龍眼體細胞胚胎發(fā)生過程中的內(nèi)源激素變化[J]. 熱帶作物學報， 2002， 23（2）： 41-47.

Dodeman V L， Ducreux G， Kreis M. Review article： Zygotic embryogenesis versus somatic embryogenesis[J]. Journal of Experimental Botany， 1997， 48（8）： 1493-1509.

Willemsen V， Scheres B. Mechanisms of pattern formation in plant embryogenesis[J]. Annual Review of Genetics， 2004， 38： 587-614.

Zimmerman J L. Somatic embryogenesis： a model for early development in higher plants[J]. The Plant Cell， 1993， 5（10）： 1411-1423.

賴鐘雄， 潘良鎮(zhèn)， 陳振光. 龍眼胚性細胞系的建立與保持[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學學報（自然版）， 1997（2）： 160-167.

賴鐘雄， 陳振光. 龍眼胚性愈傷組織的高頻率體細胞胚胎發(fā)生[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學學報（自然版）， 1997， 26（3）： 271-276.

Lin Y L， Min J M， Lai R L， et al. Genome-wide sequencing of longan （Dimocarpus longan Lour.） provides insights into molecular basis of its polyphenol-rich characteristics[J]. Gigascience， 2017， 6（5）： 1-14.

魏文雄， 楊永青. 龍眼子葉胚狀體的誘導和試管苗的培育[J]. 福建師范大學學報（自然科學版）， 1981（2）： 102-106.

楊永青， 魏文雄. 龍眼花粉植株的誘導[J]. 遺傳學報， 1984（4）： 288-293.

周麗儂， 馬雪筠， 陳俊秋. 龍眼的組織培養(yǎng)[J]. 植物生理學通訊， 1986（4）： 51-52.

楊永青， 陳志峰. 焦核龍眼果實遺傳性狀及胚培養(yǎng)的研究[J]. 園藝學報， 1987， 14（4）： 217-222， 292.

Litz R E. Somatic embryogenesis from cultured leaf explants of the tropical tree Euphoria longan Stend[J]. Journal of Plant Physiology， 1988， 132（2）： 190-193.

葉? 煒， 賴鐘雄， 陳義挺， 等. 51份龍眼種質(zhì)的胚性愈傷組織誘導及其離體保存[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版）， 2007， 36（1）： 28-33.

林秀蓮， 賴鐘雄. 龍眼胚性愈傷組織限制生長保存及其染色體數(shù)目變異[J]. 熱帶作物學報， 2009， 30（10）： 1488-1494.

賴鐘雄， 陳振光. 龍眼胚性細胞懸浮培養(yǎng)再生植株[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2002， 8（5）： 485-491.

賴鐘雄， 陳振光. 龍眼單細胞培養(yǎng)及其體胚發(fā)生再生植株[J]. 熱帶作物學報， 2003， 24（2）： 16-18， 98.

賴鐘雄， 陳振光. 龍眼胚性懸浮細胞原生質(zhì)體培養(yǎng)及其體胚發(fā)生再生植株[J]. 熱帶作物學報， 2002， 23（3）： 53-60， 95.

賴鐘雄， 陳振光. 龍眼荔枝屬間原生質(zhì)體電融合[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學學報， 2001（3）： 347-352.

黃? 淺， 賴鐘雄， 賴呈純， 等. 荔枝TPEC與龍眼EC的電融合參數(shù)研究[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版）， 2014， 43（4）： 361-368.

陳春玲， 賴鐘雄. 龍眼胚性愈傷組織體胚發(fā)生同步化調(diào)控及組織細胞學觀察[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版）， 2002， 31（2）： 192-194.

王鳳華， 賴鐘雄， 鄭金貴， 等. 龍眼胚性愈傷組織體胚發(fā)生的同步化調(diào)控及其DNA與RNA的提取方法[J]. 熱帶作物學報， 2003， 24（3）： 31-35.

方智振， 賴鐘雄. 龍眼體胚發(fā)生中期發(fā)育同步化的初步調(diào)控[J]. 中國農(nóng)學通報， 2009， 25（1）： 152-155.

陳春玲， 賴鐘雄. 龍眼體細胞胚胎發(fā)生過程中內(nèi)源多胺的變化[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版）， 2006， 35（4）： 381-383.

李冬梅. 龍眼體細胞胚胎成熟機理的研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2003.

陳春玲. 龍眼體細胞胚胎發(fā)生機理的初步研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2001.

郭志雄. 龍眼胚胎乙醇脫氫酶的分離純化、鑒定及其cDNA克隆[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2006.

邵? 巍， 賴鐘雄， 賴呈純， 等. 龍眼胚性培養(yǎng)物APX同工酶的分析方法建立及其在龍眼體胚發(fā)生過程中的變化[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版）， 2008， 37（2）： 140-144.

陳義挺， 賴鐘雄， 林玉玲， 等. 溫度對龍眼體胚發(fā)生早期POD活性及同工酶的影響[J]. 中國農(nóng)學通報， 2009， 25（9）： 32-37.

Li H S， Lyu Y M， Chen X H， et al. Exploration of the effect of blue light on functional metabolite accumulation in longan embryonic calli via RNA sequencing[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（2）： 441.

李漢生， 姚德恒， 陳曉慧， 等. 藍光對龍眼細胞培養(yǎng)及類黃酮代謝的影響[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（4）： 77-84.

廖? 斌， 李漢生， 徐小萍， 等. 不同光照條件對龍眼胚性懸浮細胞培養(yǎng)及柯里拉京合成的影響[J]. 福建農(nóng)業(yè)學報， 2019， 34（1）： 27-34.

崔彤彤. 溫度與SA對龍眼培養(yǎng)細胞類黃酮和類胡蘿卜素的影響[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2017.

詹陳巧. 基本培養(yǎng)基和激素對龍眼EC類黃酮和類胡蘿卜素的影響[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2017.

徐小萍， 賴瑞聯(lián)， 林玉玲， 等. 真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織生長和多糖積累的影響[J]. 熱帶作物學報， 2016， 37（11）： 2216-2221.

劉生財， 段俊朋， 徐小萍， 等. 真菌誘導子對龍眼胚性愈傷組織中類黃酮、類胡蘿卜素和單寧含量的影響[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（9）： 1778-1785.

陳春玲， 賴鐘雄. 龍眼體胚發(fā)生過程中特異蛋白的IEF和SDS-PAGE分析[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版）， 2002， 31（1）： 135-136.

王鳳華. 龍眼體細胞胚胎發(fā)生過程中的基因差別表達[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2003.

安? 娜， 賴鐘雄， 郭志雄. 龍眼體細胞胚胎發(fā)生過程中特異表達蛋白的雙向電泳分析[J]. 福建農(nóng)林大學學報（自然科學版）， 2007， 36（3）： 244-249.

郭玉瓊. 龍眼、荔枝胚性培養(yǎng)物超低溫保存研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2007.

何? 園. 龍眼體胚成熟過程的蛋白質(zhì)組學研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2009.

賴呈純. 龍眼體胚發(fā)生早期的蛋白質(zhì)組學研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2010.

方智振. 龍眼體胚發(fā)生中期的蛋白質(zhì)組學及Ran家族表達調(diào)控研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2012.

方智振， 賴鐘雄， 賴呈純， 等. 龍眼體細胞胚發(fā)生中期的蛋白質(zhì)組學研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2011， 44（14）： 2966- 2979.

李? 然， 賴鐘雄， 賴呈純， 等. 龍眼松散型胚性愈傷組織發(fā)生過程中相關(guān)蛋白的表達分析[J]. 西北植物學報， 2015， 35（1）： 107-117.

陳裕坤. 龍眼體胚發(fā)生早期轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學分析及開花時間相關(guān)基因表達與功能分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2018.

Lai Z X， Lin Y L. Analysis of the global transcriptome of longan （Dimocarpus longan Lour.） embryogenic callus using Illumina paired-end sequencing[J]. BMC Genomics， 2013， 14（1）： 561.

Chen Y K， Xu X P， Liu Z X， et al. Global scale transcriptome analysis reveals differentially expressed genes involve in early somatic embryogenesis in Dimocarpus longan Lour. [J]. BMC Genomics， 2020， 21（1）： 4.

陳榮珠. 龍眼體細胞胚胎發(fā)生早期AGO基因家族的全基因組鑒定、表達與功能分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2020.

Lin Y L， Lai Z X. Comparative analysis reveals dynamic changes in miRNAs and their targets and expression during somatic embryogenesis in longan （Dimocarpus longan Lour.）[J]. PLoS One， 2013， 8（4）： e60337.

Xu X P， Chen X H， Chen Y， et al. Genome-wide identification of miRNAs and their targets during early somatic embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 4626.

Li H S， Chen X H， Wang Y， et al. Exploration of the effect of blue light on microRNAs involved in the accumulation of functional metabolites of longan embryonic calli through RNA-sequencing[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2019， 99： 1533-1547.

Chen Y， Li X， Su L Y， et al. Genome-wide identification and characterization of long non-coding RNAs involved in the early somatic embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.[J]. BMC Genomics， 2018， 19（1）： 805.

郝玉金， 鄧秀新. 逆境處理和DNA甲基化影響柑橘體細胞胚發(fā)生[J]. 植物學報（英文版）， 2002， 44（6）： 673-677.

Chakrabarty D， Yu K W， Paek K Y. Detection of DNA methylation changes during somatic embryogenesis of Siberian ginseng （Eleuterococcus senticosus）[J]. Plant Science， 2003， 165（1）： 61-68.

Santos D， Fevereiro P. Loss of DNA methylation affects somatic embryogenesis in Medicago truncatula[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 2002， 70（2）： 155-161.

楊曼曼. 龍眼胚性愈傷組織AGO基因克隆與表達分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2015.

楊曼曼， 林玉玲， 王天池， 等. 龍眼胚性愈傷組織AGO2基因克隆及其在體胚發(fā)生過程中的表達分析[EB/OL]. 北京：中國科技論文在線. （2015-06-17）[2020-07-25]. http：// www.paper.edu.cn/releasepaper/content/ 201506-176.

楊曼曼， 林玉玲， 王天池， 等. 龍眼胚性愈傷組織AGO6基因克隆及其在體胚發(fā)生過程中的表達分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報， 2015， 37（1）： 141-148.

陳榮珠， 申? 序， 林美珍， 等. 龍眼體胚發(fā)生過程中DlAGO4基因的克隆及表達分析[J]. 西北植物學報， 2020， 40（5）： 747-755.

陳榮珠， 劉轉(zhuǎn)霞， 陳曉慧， 等. 龍眼胚性愈傷組織AGO10基因克隆及其表達分析[J]. 果樹學報， 2019， 36（3）： 286- 295.

陳曉慧. 龍眼體胚發(fā)生過程中DlDCLs的克隆與功能分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2018.

陳曉慧， 白? 玉， 陳? 旭， 等. 龍眼體胚發(fā)生過程中DCL基因的分子特性及表達分析[J]. 西北植物學報， 2017， 37（11）： 2120-2129.

陳曉慧， 白? 玉， 李漢生， 等. 龍眼DCL家族基因的啟動子分析及時空表達[J]. 西北植物學報， 2017， 37（10）： 1926-1933.

白? 玉. 龍眼體胚發(fā)生過程中DlDRMs的克隆與功能分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2018.

白? 玉， 陳曉慧， 謝禮洋， 等. 龍眼胚性愈傷組織DRM1基因的克隆及其定位與表達分析[J]. 西北植物學報， 2017， 37（11）： 2097-2105.

Chen X H， Xu X P， Shen X， et al. Genome-wide investigation of DNA methylation dynamics reveals a critical role of DNA demethylation during the early somatic embryogenesis of Dimocarpus longan Lour.[J/OL]. Tree Physiology， 2020[2020-07-27]. https：//doi.org/10.1093/treephys/tpaa097.

王鳳華， 賴鐘雄， 鄭金貴， 等. 龍眼體細胞胚胎發(fā)生過程的基因差異表達[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報， 2005， 13（6）： 703-708.

陳義挺， 賴鐘雄， 方智振， 等. 龍眼體胚CDC48基因的克隆、原核表達及其在體胚發(fā)生過程中的表達分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學報， 2014， 22（3）： 233-241.

Lin Y L， Lai Z X. Superoxide dismutase multigene family in longan somatic embryos： a comparison of CuZn-SOD， Fe-SOD， and Mn-SOD gene structure， splicing， phylogeny， and expression[J]. Molecular Breeding， 2013， 32（3）： 595- 615.

任敬敬. 龍眼體胚發(fā)生過程中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因的克隆及其表達分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2013.

蔡英卿. 龍眼體胚發(fā)生過程中SERK等胚性相關(guān)基因的克隆與表達分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2011.

張冬敏， 田奇琳， 楊曼曼， 等. 龍眼體細胞胚胎發(fā)生過程中DlWUS的克隆與表達分析[J]. 西北植物學報， 2015， 35（5）： 890-897.

李惠華. 龍眼體胚發(fā)生過程中激素代謝和信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因的克隆與表達[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2010.

林麗霞. 龍眼體胚發(fā)生過程中與ARF相關(guān)小分子RNA的功能研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2015.

賴瑞聯(lián)， 鐘春水， 林玉玲， 等. 龍眼生長素受體基因TIR1的克隆及表達分析[J]. 熱帶作物學報， 2016， 37（1）： 136-143.

賴瑞聯(lián)， 林玉玲， 賴鐘雄. 龍眼生長素受體基因TIR1的克隆及其與miR393互作關(guān)系[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2016， 22（1）： 95-102.

馬金玉. 龍眼體胚發(fā)生過程中若干PCD相關(guān)基因的克隆及表達[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2011.

蔡愛萍. 龍眼古樹EC離體保存及其WRKY基因家族的克隆與表達[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2013.

葉? 煒. 龍眼胚性培養(yǎng)物抗性相關(guān)基因的克隆與功能鑒定[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2015.

陳裕坤， 徐? 洋， 屈? 瑩， 等. 龍眼胚性愈傷組織Remorin家族成員的克隆及其在體胚發(fā)生過程中的表達分析[J]. 園藝學報， 2014， 41（11）： 2299-2312.

陳裕坤， 林玉玲， 田奇琳， 等. 龍眼胚性愈傷組織DlGRAS4與DlGRAS54基因的克隆及表達分析[J]. 西北植物學報， 2014， 34（2）： 215-224.

Fang Z Z， Lai C C， Zhang Y L， et al. Identification of a PTC-containing DlRan transcript and its differential expre ssion during somatic embryogenesis in Dimocarpus longan[J]. Gene， 2013， 529（1）： 37-44.

Fang Z Z， Zhang Y L， Lai C C， et al. Developmental regulation of Ran 3' untranslated region during somatic embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.[J]. Scientia Horticulturae， 2014， 176： 297-302.

田奇琳， 林玉玲， 賴鐘雄， 等. 龍眼胚性愈傷組織DlRan3A和DlRan3B基因啟動子的克隆及其生物信息學分析[J]. 熱帶作物學報， 2014， 35（1）： 82-89.

Tian Q L， Lin Y L， Zhang D M， et al. Ras-related nuclear protein Ran3B gene is involved in hormone responses in the embryogenic callus of Dimocarpus longan Lour.[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2016， 17（6）： 873.

Tian Q L， Lin Y L， Yang M M， et al. DlRan3A is involved in hormone， light， and abiotic stress responses in embryogenic callus of Dimocarpus longan Lour.[J]. Gene， 2015， 569（2）： 267-275.

Chen Y K， Xu X P， Chen X H， et al. Seed-specific gene MOTHER of FT and TFL1（MFT） involved in embryogenesis， hormones and stress responses in Dimocarpus longan Lour.[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2018， 19（8）： 2403.

Lin Y L， Lai Z X. Reference gene selection for qPCR analysis during somatic embryogenesis in longan tree[J]. Plant Science， 2010， 178（4）： 359-365.

陳? 燕， 呂科良， 厲? 雪， 等. 龍眼ERF家族成員鑒定及其在體胚發(fā)生早期的表達[J]. 西北植物學報， 2018， 38（11）： 1986-1999.

Zhang S T， Zhu C， Lyu Y M， et al. Genome-wide identification， molecular evolution， and expression analysis provide new insights into the APETALA2/ethylene responsive factor （AP2/ERF） superfamily in Dimocarpus longan Lour.[J]. BMC Genomics， 2020， 21（1）： 62.

Li X， Chen Y， Zhang S T， et al. Genome-wide identification and expression analyses of Sm genes reveal their involvement in early somatic embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.[J]. PLoS One， 2020， 15（4）： e0230795.

王? 云， 彭麗云， 孫雪麗， 等. 龍眼Hsf基因家族全基因組鑒定及體胚發(fā)生過程中的表達分析[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2019， 25（2）： 420-431.

劉蒲東， 張舒婷， 陳曉慧， 等. 龍眼GRF家族全基因組鑒定及表達模式[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2020， 26（2）： 236-245.

李曉斐， 張舒婷， 陳曉慧， 等. 龍眼HDAC家族成員的全基因組鑒定及表達分析[J]. 果樹學報， 2020， 37（6）： 793-807.

李漢生， 孫? 剛， 陳曉慧， 等. 龍眼BRI1基因家族的全基因組鑒定及光照響應表達[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2020， 26（1）： 125-134.

徐小萍， 陳曉慧， 呂科良， 等. 龍眼漆酶家族成員全基因組結(jié)構(gòu)與功能分析[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2018， 24（4）： 833-844.

趙鵬程， 徐小萍， 張春渝， 等. 龍眼Aquaporin家族的全基因組鑒定及其在體細胞胚發(fā)生早期的表達[J/OL]. 應用與環(huán)境生物學報， 2020. [2020-08-17]. https：//doi.org/10. 19675/j.cnki.1006-687x.2020.03040.

朱永靜， 路保順， 張舒婷， 等. 龍眼纖維素合成酶基因家族成員鑒定及表達模式[J/OL]. 應用與環(huán)境生物學報， 2020[2020-08-17]. https：//doi.org/10.19675/j.cnki.1006-687x. 2019.10009.

申? 序， 陳曉慧， 徐小萍， 等. 龍眼體細胞胚胎發(fā)生早期SDG基因家族的全基因組鑒定與表達分析[J]. 熱帶作物學報， 2019， 40（10）： 1889-1901.

王靜宇， 陳曉慧， 申? 序， 等. 龍眼體胚發(fā)生過程中RNA甲基化相關(guān)基因全基因組鑒定及表達分析[J]. 熱帶作物學報， 2019， 40（10）： 1902-1913.

孫? 瑩， 林藝靈， 趙鵬程， 等. 龍眼類受體蛋白激酶CRK家族全基因組鑒定及表達調(diào)控分析[J]. 熱帶作物學報， 2019， 40（10）： 1924-1937.

許小瓊， 陳曉慧， 申? 序， 等. 龍眼MSIL全基因組鑒定及表達分析[J]. 熱帶作物學報， 2019， 40（10）： 1938-1948.

洪平靜， 徐小萍， 王靜宇， 等. 龍眼體胚發(fā)生早期4CL基因家族鑒定與功能分析[J/OL]. 熱帶作物學報， 2020[2020- 08-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1019.S.20200528. 1748.002.html.

張春渝， 徐小萍， 陳曉慧， 等. 龍眼HD-Zip基因家族生物信息及表達分析[J]. 熱帶作物學報， 2019， 40（10）： 1914- 1923.

林玉玲. 龍眼體胚發(fā)生過程中SOD基因家族的克隆及表達調(diào)控研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2011.

Lin Y L， Lai Z X. Evaluation of suitable reference genes for normalization of microRNA expression by real-time reverse transcription PCR analysis during longan somatic embryogenesis[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2013， 66： 20-25.

王亞婷. 龍眼胚性愈傷組織中若干microRNA的初級體克隆及其功能分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2013.

Lin Y L， Lai Z X， Tian Q L， et al. Endogenous target mimics down-regulate miR160 mediation of ARF10， -16， and -17 cleavage during somatic embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.[J]. Frontiers in Plant Science， 2015， 6： 956.

Lin Y L， Lai Z X， Lin L X， et al. Endogenous target mimics， microRNA167， and its targets ARF6 and ARF8 during somatic embryo development in Dimocarpus longan Lour.[J]. Molecular Breeding， 2015， 35（12）： 227.

蘇立遙， 蔣夢琦， 黃倏祺， 等. miR403分子進化特性及其在龍眼體胚發(fā)生早期的表達模式分析[J]. 果樹學報， 2019， 36（7）： 846-856.

黃倏祺， 蘇立遙， 蔣夢琦， 等. miR395分子進化特性及其在龍眼早期體胚發(fā)生中的表達分析[J]. 果樹學報， 2020， 37（1）： 18-28.

林玉玲， 張清林， 曾友競， 等. 龍眼miR166家族的分子進化特性及時空表達分析[J]. 園藝學報， 2017， 44（12）： 2285-2295.

徐小萍， 廖? 琪， 陳? 旭， 等. 龍眼miR397家族成員分子特性及其在體胚發(fā)生早期的表達分析[J]. 果樹學報， 2019， 36（5）： 567-577.

陳? 旭， 曾友競， 王嘉毅， 等. 龍眼miR159家族成員進化特性及時空表達[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2017， 23（4）： 602-608.

蘇立遙， 張? 帥， 陳? 旭， 等. miR171家族成員分子特性及miR171b調(diào)控靶標在龍眼體胚發(fā)生早期的表達分析[J]. 果樹學報， 2018， 35（11）： 1324-1334.

張舒婷， 朱? 晨， 王培育， 等. 龍眼miR172家族成員進化特性及其時空表達分析[J]. 果樹學報， 2017， 34（11）： 1385-1393.

張清林， 蘇立遙， 厲? 雪， 等. 龍眼體胚發(fā)生早期miR166初級體的克隆與表達分析[J]. 園藝學報， 2018， 45（8）： 1501-1512.

蘇立遙， 黃倏祺， 蔣夢琦， 等. 龍眼miR403及其候選靶標對外源激素的響應模式以及在龍眼體胚中的表達模式[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2019， 25（4）： 977-984.

蘇立遙， 陳? 旭， 黃倏祺， 等. eTM、microRNA319及其調(diào)控靶標在龍眼體胚發(fā)生早期的表達模式[J]. 應用與環(huán)境生物學報， 2020， 26（3）： 566-573.

Zhang Q L， Su L Y， Zhang S T， et al. Analyses of microRNA166 gene structure， expression， and function during the early stage of somatic embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2019， 147： 205-214.

李漢生. 光對龍眼細胞培養(yǎng)中功能性代謝產(chǎn)物的影響及分子機制[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2018.

陳裕坤， 程春振， 張梓浩， 等. 一種龍眼快速遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立[J/OL]. 應用與環(huán)境生物學報， 2020[2020-08-17]. https：//doi.org/10.19675/j.cnki.1006-687x.2019.11008.

田奇琳. 龍眼胚性培養(yǎng)物DlRan3A和DlRan3B基因的功能分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2017.

曾黎輝. 龍眼遺傳轉(zhuǎn)化研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 1998.

賴鐘雄. 龍眼生物技術(shù)研究[M]. 福州： 福建科學技術(shù)出版社， 2003.

張妙霞. 香蕉與龍眼轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立及轉(zhuǎn)化PEAS基因初步研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2004.

鄭啟發(fā)， 胡桂兵， 陳大成， 等. 荔枝龍眼細胞懸浮培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因研究[J]. 果樹學報， 2005， 22（2）： 125-128.

徐清鋒. 龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)的優(yōu)化及其在種質(zhì)保存與遺傳轉(zhuǎn)化上的應用[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2010.

曾麗蘭. 龍眼胚性愈傷組織SOD的表達分析及啟動子功能鑒定[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2013.

張冬敏. 龍眼體胚發(fā)生過程中WUS-CLV通路相關(guān)基因的克隆與表達分析[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2016.

賴瑞聯(lián). 龍眼TIR1與miR393在體胚發(fā)生過程中的表達調(diào)控研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學， 2016.