胡麗松 吳思婷 段興帥 岑怡 蘇岳峰 范睿 伍寶朵 郝朝運(yùn)

摘? 要：為系統(tǒng)篩選適合胡椒基因表達(dá)模式分析的內(nèi)參基因，本研究基于胡椒全基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，初步篩選出62個(gè)候選基因。以胡椒主根、芽尖、葉片、花穗、不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)以及接種辣椒疫霉菌的主蔓為材料，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件系統(tǒng)分析候選基因在不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)合目標(biāo)基因的表達(dá)模式驗(yàn)證，鑒定穩(wěn)定表達(dá)最優(yōu)的內(nèi)參基因?yàn)镸yeloid leukemia factor 1 （Pn17.1212）。結(jié)果表明：該基因是分析胡椒果實(shí)發(fā)育、辣椒疫霉菌響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)模式的理想內(nèi)參。內(nèi)參基因的選擇不應(yīng)僅限于持家基因，全基因組和轉(zhuǎn)錄組信息可提供更加全面的參考基因數(shù)據(jù)，內(nèi)參基因的準(zhǔn)確鑒定需綜合轉(zhuǎn)錄組信息、基因表達(dá)穩(wěn)定性、標(biāo)記基因的表達(dá)模式驗(yàn)證等數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，獲得的理想內(nèi)參基因可滿(mǎn)足不同研究對(duì)表達(dá)穩(wěn)定性的要求。

關(guān)鍵詞：胡椒;內(nèi)參基因;表達(dá)穩(wěn)定性

中圖分類(lèi)號(hào)：S813.3? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to identify the internal control gene for the gene expression analysis in black pepper， 62 candidate internal control genes were selected by a preliminary assessment of genome and transcriptome data. The stability of gene expression was investigated using geNorm， NormFinder and BestKeeper in a diverse set of 16 samples， including root， shoot apices， leaf， flower， fruits at different developmental stages and the stems at different time after inoculated with Phytophthora capsici. By combining with the expression pattern of target gene， the gene Myeloid leukemia factor 1 （Pn17.1212） with ideal stable expression was identified. It can be considered as an ideal internal control gene in the analysis gene expression pattern of fruit development and Phytophthora capsica infection. The selection of internal reference genes should not be limited to housekeeping genes， the genome and transcriptome data could provide more candidate genes. The identification of internal reference genes should require a comprehensive analysis such as transcriptome， expression stability and expression pattern validation of marker genes. An ideal internal control gene could be applied in different researches with different requirement of the stability of expression.

Keywords： black pepper; internal control gene; the stability of expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.10.018

胡椒（Piper nigrum L.）為胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（Piper）熱帶木質(zhì)藤本作物，素有“香料之王”的美譽(yù)，是世界上重要的香辛料作物之一 。胡椒廣泛種植于熱帶、亞熱帶30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，是服務(wù)國(guó)家“一帶一路”倡議的重要媒介作物。我國(guó)胡椒種植面積與年產(chǎn)量均居世界第5位，已發(fā)展成為年產(chǎn)值超20億，關(guān)系到100萬(wàn)以上農(nóng)村人口就業(yè)的重要熱作產(chǎn)業(yè)，是助力當(dāng)?shù)鼐珳?zhǔn)扶貧的特色作物產(chǎn)業(yè)[1]。胡椒是首批入選“藥食同源”的香料作物之一，在中醫(yī)藥研究和人民健康飲食領(lǐng)域有著不俗潛力[2]。我國(guó)胡椒主栽品種為‘熱引1號(hào)，占總種植面積的90%以上，由辣椒疫霉菌引起的胡椒瘟病是限制胡椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最重要的病害。另外，胡椒優(yōu)勢(shì)種植區(qū)之間環(huán)境差異較大，各產(chǎn)區(qū)胡椒品質(zhì)良莠不齊，影響我國(guó)胡椒的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。高抗胡椒瘟病和高胡椒堿的優(yōu)異新品種選育是亟需解決的產(chǎn)業(yè)問(wèn)題。由于世界胡椒產(chǎn)業(yè)主要分布在熱帶地區(qū)的發(fā)展中國(guó)家，該地區(qū)科研水平相對(duì)落后，分子育種技術(shù)的研發(fā)仍缺乏可應(yīng)用的基因資源。

基因表達(dá)模式分析是分子生物學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究中，理想的內(nèi)參基因是目標(biāo)基因表達(dá)模式分析的最基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)之一[3-4]。在研究不同性狀相關(guān)基因的表達(dá)特性時(shí)，穩(wěn)定內(nèi)參基因的篩選和鑒定不可或缺[5-7]。中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所胡麗松等[8]以胡椒栽培種‘熱引1號(hào)的主根、主蔓、花序和不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)為材料，分析了9個(gè)持家基因的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出適合做胡椒果實(shí)發(fā)育的內(nèi)參基因Histion 3-1和Polyubiquitin 1。印度香料研究所Palaniyandi等[9]參考胡椒葉片轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)，以辣椒疫霉菌處理后不同發(fā)育時(shí)期的葉片為材料，篩選出適用于辣椒疫霉菌抗性相關(guān)基因表達(dá)分析的內(nèi)參PnGAPDH。盡管上述研究已經(jīng)篩選出表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，與模式作物相比，仍有一定的缺陷。首先，由于胡椒全基因組信息的缺失，內(nèi)參基因的參考序列數(shù)據(jù)不夠全面。其次，候選基因的選擇根據(jù)持家基因的功能注釋查找同源序列，基因的選擇受到限制，相應(yīng)的內(nèi)參基因的評(píng)估并不理想。另外，研究者根據(jù)各自的需求，分別單獨(dú)對(duì)胡椒抗瘟病和果實(shí)發(fā)育2個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程展開(kāi)研究，篩選的內(nèi)參基因在不同的組織之間并不通用。因此，適合胡椒分子生物學(xué)研究需要的內(nèi)參基因仍有待進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

胡椒全基因組測(cè)序工作的完成和不同組織轉(zhuǎn)錄組信息的完善，為內(nèi)參基因的鑒定提供了豐富的數(shù)據(jù)來(lái)源[10-12]。為系統(tǒng)鑒定胡椒理想的內(nèi)參基因，本研究在胡椒全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)基因表達(dá)變異系數(shù)（CV）的大小篩選內(nèi)參基因候選序列，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析，結(jié)合基因表達(dá)模式驗(yàn)證，系統(tǒng)鑒定出穩(wěn)定的基因。研究結(jié)果為胡椒差異表達(dá)基因的篩選提供了內(nèi)參基因，也為其他非模式作物的內(nèi)參基因鑒定提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以我國(guó)胡椒主栽品種‘熱引1號(hào)（P. nigrum cv. Reyin-1）為材料，樹(shù)齡15 a，種植于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部萬(wàn)寧胡椒種質(zhì)資源圃。收集胡椒主根、芽尖、葉片、花序、不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)（開(kāi)花后2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、8個(gè)月），以及經(jīng)胡椒瘟病病菌接種的主蔓（菌感染0、4、8、12、24、48、72 h）和空白對(duì)照的主蔓混合樣（無(wú)菌水接種0、4、8、12、24、48、72 h）共16個(gè)組織，其中，根據(jù)辣椒疫霉菌的發(fā)病特征，主蔓接種位置選擇為地上20 cm處，每個(gè)組織從不同的植株上取樣3次，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? RNA提取和cDNA合成? 所有樣品在液氮下研磨成粉末，總RNA提取按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取RNA后用Nanodrop 2000C測(cè)定RNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性及純度。取1 μg總RNA，按照全式金TransGen反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA模版，以1∶10稀釋后于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增? 根據(jù)項(xiàng)目組前期公布的胡椒全基因組信息和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選取表達(dá)變異系數(shù)小于8以及已經(jīng)報(bào)道的1個(gè)內(nèi)參基因Polyubiquitin 1，共63個(gè)候選基因。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物。候選基因擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，在延伸階段采集熒光信息，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后，進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，溫度從60 ℃緩慢遞增至95 ℃，連續(xù)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度，根據(jù)溶解曲線(xiàn)熒光變化確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析按照SYBR PremixExTaqTM II試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，擴(kuò)增測(cè)序?yàn)閮刹椒ǎ?5 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s并收集熒光信號(hào)，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，根據(jù)Ct值（cycle threshold mean）計(jì)算基因表達(dá)豐度[13]。

1.2.3? 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析? 讀取每個(gè)反應(yīng)的Ct值，利用內(nèi)參基因分析軟件geNorm、NormFinder和BestKeeper分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。其中，軟件geNorm、NormFinder以基因的2?ΔΔCt為輸入數(shù)據(jù)，具體方法為：首先找到候選基因在所有樣品中的最小Ct值，用其他樣品的Ct值減去最小Ct值，得到ΔΔCt，利用excel函數(shù)

計(jì)算2?ΔΔCt值，獲得分析所需原始數(shù)據(jù)。軟件geNorm通過(guò)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化的配對(duì)差異分析值（Vn/Vn+1）來(lái)確認(rèn)內(nèi)參基因的合適數(shù)量，默認(rèn)V值為0.15，若Vn/Vn+1<0.15，則最適內(nèi)參基因的數(shù)量為n個(gè)，若Vn/Vn+1>0.15，則最適內(nèi)參基因的數(shù)量為n+1個(gè)。Bestkeeper直接以Ct值為分析數(shù)據(jù)，計(jì)算候選基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）值，選擇SD和CV值最小的基因?yàn)閮?nèi)參基因。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 候選內(nèi)參基因的引物設(shè)計(jì)與特異性鑒定

根據(jù)62個(gè)候選基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，引物退火溫度為58 ℃，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為100～200 bp，同時(shí)選取已報(bào)道的胡椒內(nèi)參基因Polyubiquitin 1作為對(duì)照，引物信息見(jiàn)表1。以16個(gè)組織的cDNA為混合模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析基因的擴(kuò)增及溶解曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，候選基因的擴(kuò)增曲線(xiàn)呈指數(shù)分布，溶解曲線(xiàn)信號(hào)峰特異，表明引物擴(kuò)增產(chǎn)物特異，無(wú)非特異擴(kuò)增帶，可用于后續(xù)表達(dá)穩(wěn)定性分析（圖1）。

2.2? 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.2.1? 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性geNorm分析? geNorm軟件通過(guò)對(duì)內(nèi)參基因在不同胡椒組織中的平均表達(dá)穩(wěn)定指數(shù)（the gene stability measure value，M值）的排序來(lái)確定最穩(wěn)定表達(dá)的基因，M值越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差。結(jié)果表明，以M<0.5為閾值時(shí)，共有40個(gè)候選基因符合要求（圖2）。由內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化的配對(duì)差異分析值（Vn/Vn+1）發(fā)現(xiàn)，候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)化配對(duì)差異值（Vn/Vn+1）均小于0.15，說(shuō)明候選內(nèi)參基因的整體表達(dá)穩(wěn)定性較好，符合條件的候選基因中只需要選擇2個(gè)作為內(nèi)參基因即可滿(mǎn)足不同組織中基因表達(dá)分析的要求（圖3）。為進(jìn)一步明確最優(yōu)的內(nèi)參基因，本研究同時(shí)采用NormFinder和BestKeeper軟件分析候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性。

2.2.2? 候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性NormFinder分析? NormFinder軟件通過(guò)計(jì)算不同樣品組間的方差評(píng)估候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值，穩(wěn)定值越低，基因表達(dá)越穩(wěn)定。由圖4可知，候選基因表達(dá)穩(wěn)定性最好的5個(gè)序列編號(hào)分別是Pn3.3865、Pn1.1328、Pn17.1212、Pn5.3111、Pn6.1073。

2.2.3? 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性BestKeeper分析? BestKeeper軟件通過(guò)比較SD和CV值的大小，分析各基因的穩(wěn)定性，SD越小，CV值越小，基因穩(wěn)定性就越好。候選內(nèi)參基因在胡椒全組織、胡椒果實(shí)發(fā)育以及胡椒瘟病病菌誘導(dǎo)組織中的表達(dá)穩(wěn)定性BestKeeper分析結(jié)果如表2所示，表達(dá)穩(wěn)定性最好的5個(gè)供測(cè)序列編號(hào)分別為：Pn14.1802、Pn15.1270、Pn13.1022、Pn17.1212、Pn3.100。

2.3? 候選內(nèi)參基因的鑒定與驗(yàn)證

綜合轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)中候選基因的CV值和不同軟件的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因Myeloid leukemia factor 1（Pn17.1212）在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CV值最低，并且在NormFinder和BestKeeper分析結(jié)果中，該基因的表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估均排在前5名以?xún)?nèi)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在實(shí)際表達(dá)模式分析中的效果，我們分別以Pn17.1212和Pn3.100、Pn17.1212、Pn5.311三個(gè)候選基因組合為內(nèi)參，分析5個(gè)具有不同表達(dá)模式基因在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，單獨(dú)以Pn17.1212和以3個(gè)基因組合作為內(nèi)參，均可一致地反應(yīng)出不同基因的表達(dá)差異，且兩組結(jié)果之間基因表達(dá)模式相對(duì)一致（圖5）。因此，我們認(rèn)為基因Myeloid leukemia factor 1（Pn17.1212）是本研究中最優(yōu)的內(nèi)參基因，可滿(mǎn)足胡椒不同組織間特異表達(dá)基因、果實(shí)發(fā)育相關(guān)基因和辣椒疫霉菌侵染響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)模式分析。

3? 討論

內(nèi)參基因在cDNA模板均一化、基因表達(dá)模式分析中起重要作用。持家基因（Housekeeping gene）組成型、穩(wěn)定表達(dá)的特征使其成為天然的內(nèi)參基因最佳候選[14-15]。在擬南芥、水稻、棉花等模式植物和重要經(jīng)濟(jì)作物中，相應(yīng)的內(nèi)參基因已經(jīng)被鑒定[16-18]。除了持家基因外，在轉(zhuǎn)錄組等數(shù)字測(cè)序技術(shù)中，基因表達(dá)變異系數(shù)通常用來(lái)評(píng)估基因表達(dá)差異的程度，CV值也可用于基因表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估[19-20]。本研究基于已有的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中基因表達(dá)變異系數(shù)，綜合多個(gè)分析結(jié)果篩選出Myeloid leukemia factor 1（Pn17.1212）等穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)參。與已報(bào)道的研究相比，該結(jié)果在候選基因來(lái)源、評(píng)估方法、評(píng)估結(jié)果等方面具有一定的創(chuàng)新性。

本研究基于胡椒全基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)在基因表達(dá)CV值的基礎(chǔ)上初步篩選了62個(gè)候選基因，候選基因的分析數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已報(bào)道的同類(lèi)研究。geNorm的結(jié)果發(fā)現(xiàn)有40個(gè)候選基因均可滿(mǎn)足M<0.5的閾值，同時(shí)配對(duì)差異分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的Vn/Vn+1值均小于0.15，表明本研究候選基因整體質(zhì)量較高。且候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于已報(bào)道的胡椒內(nèi)參基因，如Myeloid leukemia factor 1， Casein kinase，Beta-gala cto sidase。一般認(rèn)為單一的內(nèi)參基因往往無(wú)法滿(mǎn)足不同組織對(duì)于均一化的需求，在實(shí)際分析中，往往會(huì)篩選多個(gè)內(nèi)參基因。geNorm配對(duì)變異系數(shù)分析建議采取2～3個(gè)內(nèi)參組合用于分析。為驗(yàn)證候選基因的實(shí)際效果，我們選擇了綜合評(píng)估最優(yōu)的Myeloid leukemia factor 1（Pn17.1212）為內(nèi)參基因，同時(shí)設(shè)定Pn3.100、Pn17.1212、Pn5.311作為組合內(nèi)參基因，分析了供測(cè)基因表達(dá)情況，結(jié)果表明2種內(nèi)參基因的分析結(jié)果高度一致，即本研究中鑒定的內(nèi)參基因可以滿(mǎn)足胡椒不同組織中特異表達(dá)基因、果實(shí)發(fā)育相關(guān)基因和辣椒疫霉菌相應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)模式分析。

總體而言，在數(shù)據(jù)結(jié)果上，本研究為胡椒分子生物學(xué)研究提供了理想的內(nèi)參基因：Myeloid leukemia factor 1（Pn17.1212）。同時(shí)其他候選基因在針對(duì)不同的研究方向，如抗寒、抗病毒病、抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)等研究時(shí)仍然具有重要的參考性。在分析方法上，我們認(rèn)為候選基因的選擇不應(yīng)僅局限于持家基因，基因組及數(shù)字化轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的不斷完善是內(nèi)參基因鑒定的重要數(shù)據(jù)來(lái)源，理想的內(nèi)參基因可滿(mǎn)足不同組織的均一化要求。因此，針對(duì)不同的研究課題，系統(tǒng)全面地進(jìn)行內(nèi)參基因的鑒定仍然很有必要。

參考文獻(xiàn)

鄔華松， 楊建峰， 林麗云. 中國(guó)胡椒研究綜述[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 42（7）： 2469-2480.

Srinivasan K. Black pepper and its pungent principle-piperine： A review of diverse physiological effects[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2007， 47（8）： 735-748.

Huggett J， Dheda K， Bustin S， et al. Real-time RT-PCR normalisation， strategies and considerations[J]. Genes & Immunity， 2005， 6（4）： 279-284.

Suzuk T， Higgins P J， Crawford D R. Control selection for RNA quantitation[J]. Biotechniques， 2000， 29（2）： 332-337.

Vandesompele J， De Preter K， Pattyn F， et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology， 2002， 3（7）： 467-470.

Andersen C L， Jensen J L， Rntoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data： A model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization， applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Research， 2004， 64（15）： 5245-5250.