葉華澤，董銳，曹慧敏，錢金晶，岳學玲，姜海英,*

(1嘉興學院醫(yī)學院，浙江 嘉興；2延邊大學醫(yī)學院生理學教研室，吉林 延吉)

0 引言

機體受到缺血刺激時骨髓內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)可“歸巢”到缺血組織參與內皮修復，然而老年人自體骨髓細胞的治療對血管再生的療效不佳[1,2]。組織蛋白酶K(cathepsin K，CatK)是體內主要的彈性蛋白酶，參與缺血性血管再生過程。研究發(fā)現(xiàn)EPCs中CatK具有高表達[3-6]。本研究利用老齡小鼠下肢缺血模型，探討CatK對缺血性血管再生的作用機制，為尋找老年缺血性疾病細胞治療的新靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組

C57BL/6J小鼠(94-96周齡、25-35g)隨機分為對照組(control組)、CatK抑制劑組(CatKⅡ組)，分別腹腔注射CatK抑制劑Ⅱ(CatKⅡ，5mg/kg/d) 或等量生理鹽水。

1.2 下肢缺血模型制備

小鼠麻醉剝離腹壁下動脈并結扎，仔細分離單側股動脈、股靜脈和坐骨神經，結扎并切除股動脈，保留坐骨神經。

1.3 測定血流恢復

利用激光多普勒血流儀，分別測定術前和術后第0，4，7，14天時雙下肢血流灌注情況。軟件分析同一時間點缺血側與非缺血側的血流并計算雙側血流比值。

1.4 缺血下肢毛細血管密度測定

利用免疫組化染色法CD31單克隆抗體(Santa Cruz 公司)標記血管內皮細胞，測定毛細血管數(shù)量和密度。取5個肌肉橫切面視野，計算每個視野的毛細血管數(shù)量，取其平均值。以每高倍視野(×400)下毛細血管與肌纖維數(shù)的比值表示毛細血管密度。

1.5 蛋白表達

采用Western blot法檢測缺血骨骼肌Notch1、Cleaved Notch1、β-actin信號蛋白表達?？贵w均購于cell signaling公司。

1.6 EPC測定

骨髓和外周血內皮祖細胞以表面標記抗體(c-Kit+/CD31+)或同型對照標記抗體標記，利用流式細胞儀(FACS Calibur)檢測陽性細胞數(shù)(抗體均購置于BD Pharmingen公司 )。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據均以Mean±SE表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抑制CatK減慢缺血下肢血流恢復

兩組均可觀察到下肢缺血術后第4天開始血流逐漸恢復，術后第4天開始血流逐漸恢復，術后第7、14天CatKⅡ組缺血下肢血流恢復明顯弱于對照組(圖1A)，同樣觀察到缺血模型建立14天后CatKⅡ組缺血下肢CD31陽性細胞數(shù)量明顯少于對照組(圖1B)。提示抑制CatK明顯抑制老年小鼠缺血下肢的血流恢復。

2.2 CatK影響EPCs的動員和歸巢

表1可見，骨髓EPCs數(shù)兩組之間無顯著性差異，而CatKⅡ組外周血EPCs數(shù)明顯少于對照組。提示抑制CatK明顯減弱內皮祖細胞的動員-歸巢能力。

圖1 CatK抑制劑對缺血下肢血流恢復的影響

表1 骨髓和外周血CD31+ /c-Kit+陽性細胞百分比

2.3 EPCs的c-Notch1蛋白表達

CatKⅡ組c-Notch1蛋白表達水平與對照組相比顯著降低；Notch1表達水平兩組之間未見差異(圖2)。

圖2 EPCs 的c-Notch1、Notch1信號蛋白表達

3 討論

隨著社會老齡化程度不斷加深，下肢動脈硬化性疾病等缺血性疾病的發(fā)病率逐年上升[7-9]。骨髓干細胞誘導的血管再生治療是目前行之有效的手段，但來自于老年人自體骨髓細胞的治療對心肌梗死等老年缺血性疾病的血管再生療效不理想[10-14]。

缺血、損傷等因素均可刺激骨髓中EPCs動員-歸巢到受損組織，參與修復內皮損傷及血管再生過程，需要多種蛋白酶的水解作用。Cheng[15-16]等利用不同年齡段小鼠下肢缺血模型提出衰老明顯抑制缺血下肢血流恢復，同時證實MMP-2、CatS參與缺血性血管再生過程。Van Hinsbergh等[17]提出缺血性血管再生過程可能有多個蛋白酶直接或間接參與的蛋白水解途徑作用。Urbich等報道EPCs中CatL和CatK具有高水平表達，但僅證實CatL在促使骨髓EPCs動員-歸巢過程中發(fā)揮重要作用[18]。本研究利用CatK抑制劑觀察到CatK參與老齡小鼠缺血性血管再生過程，抑制CatK明顯減弱EPCs向缺血組織的動員-歸巢能力，并且這可能與抑制EPCs的Notch1激活有關。

Notch信號通路是在進化中高度保守的信號通路，在胚胎時期及出生后的血管再生中發(fā)揮著核心作用[19]。本實驗發(fā)現(xiàn)抑制CatK減少老齡小鼠EPCs的c-Notch1表達。Notch1發(fā)揮其生理作用的關鍵環(huán)節(jié)在于在γ-分泌酶等酶作用下的活化過程。新理論提出，包括CatK在內的組織蛋白酶不僅在溶酶體內起作用，也在細胞膜內外顯示出蛋白酶活性[20]。前期研究發(fā)現(xiàn)CatK具有類似γ-分泌酶的蛋白水解作用，激活Notch1，釋放出Notch1活性片段[21]。本研究認為衰老可能改變CatK水平和/或活性，通過激活Notch1信號通路，降低EPCs的細胞生物學功能，從而影響缺血性血管再生過程。