王濤，高園霞，王發(fā)，劉雪峰

(1.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安；2.西安力邦制藥有限公司，陜西 西安)

0 引言

鹽酸羅哌卡因注射液本品主要成份為鹽酸羅哌卡因，適用于外科手術(shù)麻醉[1-3]。鹽酸羅哌卡因化學(xué)名稱：(S)-(-)-1-丙基-N-(2，6-二甲基苯基)-2-哌啶甲酰胺甲磺酸鹽一水合物，2，6-二甲基苯胺系鹽酸羅哌卡因注射液生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)，可引起高鐵血紅蛋白血癥，造成組織缺氧；對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及肝臟損害較強(qiáng)，極易經(jīng)皮膚吸收，可引起皮炎；常用危險(xiǎn)化學(xué)品的分類及標(biāo)志(GB 13690-92)將該物質(zhì)劃為第6.1類毒害品；2，6-二甲基苯胺在世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單2B類致癌物清單中。

為了更精準(zhǔn)的控制2，6-二甲基苯胺含量，最大程度的降低該藥品在日常使用的過(guò)程中產(chǎn)生的毒副作用，本文以高效液相色譜法測(cè)定鹽酸羅哌卡因注射液中2，6-二甲基苯胺，結(jié)合中國(guó)藥典以及參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-10]，建立了高效液相色譜法測(cè)定鹽酸羅哌卡因注射液中有關(guān)物質(zhì)2，6-二甲基苯胺的定量方法。方法學(xué)結(jié)果表明本方法簡(jiǎn)便易行，精密度高，重現(xiàn)性好，具有很好的可行性，為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供較高的參考性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國(guó)Waters公司高效液相色譜儀(Alliance E2695色譜系統(tǒng)，2489紫外檢測(cè)器，Empower工作站)，瑞士梅特勒公司ME204型、XPE105型全自動(dòng)電子分析天平，超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司，KQ-500DE型)

1.2 試藥

試藥：鹽酸羅哌卡因?qū)φ掌?中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)100866-201302)；2，6-二甲基苯胺對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)100868-200801)；鹽酸羅哌卡因注射液(西安力邦制藥公司生產(chǎn)，批號(hào)：1405011、1405012、1405013)；試劑：磷酸二氫鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140311)分析純；磷酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20141225)分析純；乙腈(霍尼韋爾公司，批號(hào)：S41A1H)色譜純；水為18.3ΜΩ·CM的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Diamonsil 5μm C18，250×4.6mm)；流動(dòng)相：乙腈 - 磷酸鹽緩沖液 (取lmol·L-1 磷酸二氫鈉溶液 1.3mL，0.5mol·L-1 磷酸氫二鈉溶液 32.5mL，加水至 1000mL，調(diào)節(jié) pH 值至 7.0)(50：50)；檢測(cè)波長(zhǎng) 240nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量 20μL[4-5]。

2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取2，6-二甲基苯胺對(duì)照品9.92mg，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液。量取該儲(chǔ)備液1mL，置500mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，作為2，6-二甲基苯胺對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：取本品適量，用加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每lmL中含鹽酸羅哌卡因2mg的溶液，作為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

2.3.1 定位及空白溶液的考察

取“2.2”項(xiàng)下2，6-二甲基苯胺對(duì)照品溶液以及供試品溶液。按處方配制無(wú)鹽酸羅哌卡因的空白溶液，取上述3種溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶液不干擾2，6-二甲基苯胺的測(cè)定[6]。

2.3.2 破壞性試驗(yàn)

(1)酸破壞試驗(yàn) 取樣品溶液1mL，置10mL量瓶中，加入1mol·L-1鹽酸0.5mL混勻，室溫放置2小時(shí)，加適量氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性后，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為酸破壞溶液。

(2)堿破壞試驗(yàn) 取樣品溶液1mL，置10mL量瓶中，加入1mol·L-1氫氧化鈉溶液0.5mL混勻，室溫放置2小時(shí)，加適量鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性后，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為堿破壞溶液。

(3)高溫破壞試驗(yàn) 取樣品溶液1mL，置10mL量瓶中，60℃放置2小時(shí)，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為高溫破壞溶液。

(4)氧化破壞試驗(yàn) 取樣品溶液1mL，置10mL量瓶中，加入30%的過(guò)氧化氫溶液1mL放置6小時(shí)，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為氧化破壞溶液。

(5)光破壞試驗(yàn) 取樣品溶液1mL，置10mL量瓶中，置照度為4500LX下放置6小時(shí)，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為光照破壞溶液。

量取上述各破壞后溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由各色譜圖可看出供試品經(jīng)堿、氧化破壞后可產(chǎn)生2，6-二甲基苯胺，表明樣品溶液在堿性、氧化環(huán)境下不穩(wěn)定；酸、堿、氧化、光、熱破壞后產(chǎn)生的其它雜質(zhì)峰均不干擾鹽酸羅哌卡因及2，6-二甲基苯胺的測(cè)定[6-7]。

2.4 檢出限和定量限

取“2.2”項(xiàng)下儲(chǔ)備液，加流動(dòng)相溶解并逐步稀釋，取20μL注入液相色譜儀，以S/N=10作為定量限，以S/N=3作為檢測(cè)限，測(cè)得2，6-二甲基苯胺的定量限為0.1984ng，檢測(cè)限為0.05952ng；證明該方法靈敏度良好，能有效滿足測(cè)定需要。

2.5 線性及范圍

取“2.2”項(xiàng)下儲(chǔ)備液，量取該儲(chǔ)備液1mL，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，作為濃對(duì)照溶液。量取該濃對(duì)照溶液1mL，分別置100、20、10mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，依次作為對(duì)照品溶液(1)、(2)、(3)。量取該濃對(duì)照溶液3mL，置20mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液(4)；量取該濃對(duì)照溶液1mL，置5mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液(5)；該濃對(duì)照溶液5mL，置20mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液(6)。量取上述6個(gè)溶液各精密量取20μL，分別注入液相色譜儀中，以濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：y=96561x+19.299，回歸系數(shù)：r=0.9999。結(jié)果表明，在0.00992μg·mL-1至 0.248μg·mL-1的范圍內(nèi)，2，6- 二甲基苯胺的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系[8]。

圖1 HPLC色譜圖

圖2 破壞實(shí)驗(yàn)色譜圖

表1 2,6-二甲基苯胺線性測(cè)定結(jié)果

2.6 精密度

取“2.2”項(xiàng)下2，6-二甲基苯胺對(duì)照品溶液，取上述對(duì)照溶液20μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，各圖譜中2，6-二甲基苯胺峰面積RSD為0.25%，結(jié)果表明，本測(cè)定方法的進(jìn)樣精密度良好[9]。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下2，6-二甲基苯胺對(duì)照品溶液，分別在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)各取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，溶液在24小時(shí)室溫放置，樣品峰面積基本不變，各圖譜中2，6-二甲基苯胺峰面積RSD為0.16%。結(jié)果表明，本法測(cè)定2，6-二甲基苯胺具有良好的穩(wěn)定性[10]。

2.8 回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取2，6-二甲基苯胺對(duì)照品10.86mg，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照儲(chǔ)備液。量取該儲(chǔ)備液1mL，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照溶液。量取該儲(chǔ)備液1mL，置50mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，取該溶液1mL、量取批號(hào)為1405011樣品2mL至10mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試液，平行制備6份。量取上述6個(gè)供試樣品溶液和對(duì)照溶液各20μL注入高效液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算2，6-二甲基苯胺的加樣回收率，結(jié)果表明，本法測(cè)定2，6-二甲基苯胺準(zhǔn)確度高。

表2 2,6-二甲基苯胺回收率測(cè)定結(jié)果

表3 2,6-二甲基苯胺測(cè)定結(jié)果

2.9 耐用性

取1405011批溶液1mL，置10mL量瓶中，加入1mol·L-1氫氧化鈉溶液0.5mL混勻，室溫放置過(guò)夜，使其破壞，產(chǎn)生有關(guān)物質(zhì)2，6-二甲基苯胺，加適量鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性后，用流動(dòng)相稀釋至刻度，作為供試品溶液，量取該溶液20μL，分別在 20、25、30、35、40℃柱溫條件下注入色譜儀，記錄色譜圖，比較不同柱溫下鹽酸羅哌卡因和2，6-二甲基苯胺峰的分離情況。由結(jié)果可看出5種條件下，柱溫的變化對(duì)兩個(gè)物質(zhì)分離情況無(wú)影響，該方法對(duì)溫度耐用性良好。

2.10 樣品檢測(cè)

取三批樣品 (批號(hào)：1405011、1405012、1405013)，照“2.2”項(xiàng)下制成供試品溶液以及2，6-二甲基苯胺對(duì)照品溶液，取以上兩種溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算，2，6-二甲基苯胺不得過(guò)標(biāo)示量的0.01%，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

為了能夠確保各組分可以完全分離且分離度較好，故選用長(zhǎng)的色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(Diamonsil 5μm C18，250×4.6mm)；為了得到更好的分離條件和峰型，我們?cè)鴮⒘姿猁}緩沖液pH調(diào)為6.0、6.2、6.5、7.0、7.2等多種流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)綜合考慮和分析，當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖液 (取 lmol·L-1磷酸二氫鈉溶液 1.3mL，0.5mol·L-1磷酸氫二鈉溶液32.5mL，加水至1000mL，調(diào)節(jié)pH 值至7.0)(50：50)時(shí)，樣品穩(wěn)定性好，各峰之間分離度、保留時(shí)間、理論塔板數(shù)、拖尾因子等最為理想。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

取“2.2”項(xiàng)下儲(chǔ)備液，加流動(dòng)相稀釋10倍，在200～350nm下做紫外掃描，結(jié)果2，6-二甲基苯胺在240nm附近有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)定為240nm。