楊旭，王叢

(江蘇省南通市中醫(yī)院，江蘇 南通)

0 引言

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)具有較為復(fù)雜的發(fā)病機制，是周圍血管、神經(jīng)病變及感染等因素綜合作用的結(jié)果，其治療是臨床急需解決的重要難題之一。芪柏愈瘍油外用治療糖尿病足潰瘍，應(yīng)用此藥在臨床上對糖尿病足潰瘍患者進行治療，總有效率達到88.2%，臨床治療中發(fā)現(xiàn)芪柏愈瘍油可以減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，改善肉芽組織形態(tài)，促進創(chuàng)面愈合。

近代研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)的延遲以及失調(diào)與糖尿病足潰瘍創(chuàng)面延遲愈合密切相關(guān)[1]。正常的炎癥反應(yīng)是在促炎信號的調(diào)節(jié)下，炎細胞有規(guī)律的募集，炎細胞發(fā)揮作用后能從創(chuàng)面及時有序的清除，從而終止炎癥反應(yīng)，使修復(fù)過程順利過渡到增殖期。當(dāng)炎癥反應(yīng)異常時，會出現(xiàn)炎細胞消退延遲，使修復(fù)停滯在炎癥期，影響創(chuàng)面正常修復(fù)的進程，糖尿病足潰瘍創(chuàng)面就存在炎癥細胞過度浸潤、炎癥消退延遲的現(xiàn)象[2]。此次研究以芪柏愈瘍油為干預(yù)藥物，以糖尿病大鼠潰瘍模型為研究對象，采用免疫組化檢測方法，研究芪柏愈瘍油促進糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合的作用，進一步明確芪柏愈瘍油對潰瘍創(chuàng)面的作用機制，為糖尿病足潰瘍的中醫(yī)外治療法提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與實驗環(huán)境

SD雄性大鼠，8-10周齡，體重為150±20g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。動物飼養(yǎng)及無菌手術(shù)均在動物實驗室進行，實驗動物飼養(yǎng)條件符合《實驗動物普通環(huán)境及設(shè)施(編號為GB14925-200 1)》，按照《黑龍江省實驗動物管理條例》對動物進行飼養(yǎng)管理及實驗操作。飼養(yǎng)溫度為21±2℃，相對濕度40-70%，室內(nèi)明暗交替各12小時。SD大鼠分籠喂養(yǎng)，飼料與墊料均經(jīng)消毒處理，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，墊料每日更換一次，保持墊料干燥。飲用水經(jīng)煮沸后冷卻至室溫提供給動物。

1.1.2 實驗藥品

芪柏愈瘍油：中藥飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供，黃芪、黃柏、大黃、白芷、赤芍、血竭等藥物按比例配伍，制成濃度為每1mL含生藥0.85g的黃色澄清液體，密封保存。

復(fù)方紫草油：由紫草、冰片、忍冬藤、白芷組成，輔料為麻油。性狀為紫紅色澄清液體，規(guī)格為30mL/瓶。武漢健民集團葉開泰國藥(隨州)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20044385，產(chǎn)品批號171242。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病大鼠潰瘍模型的建立

(1)糖尿病大鼠模型的建立

雄性SD大鼠80只，隨機分為空白對照組(NC組)16只，糖尿病組(DM組)64只。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，于第2周注射STZ溶液，注射前所有SD大鼠需要禁食不禁水12h，造模當(dāng)日稱取所有大鼠體重，尾靜脈采血測定基礎(chǔ)血糖。按照65mg/kg的劑量對DM組大鼠一次性腹腔注射配制好的STZ溶液，建立糖尿病大鼠模型；對NC組大鼠腹腔注射等容積的0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。各組大鼠于注射STZ溶液1小時后自由進食進水，之后每日給予大鼠充足飲水和攝食，保持墊料干燥。注射STZ溶液后3天、5天、7天分別檢測大鼠尾靜脈隨機血糖，血糖值2次或2次以上≥16.7mmol/L，則判定糖尿病大鼠模型造模成功[3]。

(2)糖尿病大鼠潰瘍模型的建立

成功建立糖尿病大鼠模型2周后制作糖尿病大鼠潰瘍模型，造模前12小時所有大鼠禁食不禁水，造模前3小時禁水，按0.3mL/100g的劑量對所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液進行麻醉。將麻醉后的大鼠俯臥位放在固定板上，固定住四肢，剪毛備皮，背部正中偏左側(cè)做直徑為2.0cm ×2.0cm的圓形標(biāo)記，無菌條件下用剪刀剪去標(biāo)記處全層皮膚(深達肌肉)，止血后用生理鹽水沖洗創(chuàng)面[4]。

1.2.2 分組

未注射STZ溶液的大鼠為空白對照組(NC組)，將造模成功的糖尿病大鼠隨機分為模型組(MG組)，芪柏愈瘍油組(TG1組)、復(fù)方紫草油組(TG2組)。

1.2.3 給藥方法

(1)空白對照組(NC組)與模型組(MG組)給藥方法：碘伏消毒后，局部清創(chuàng)，用生理鹽水完全浸漬后覆蓋創(chuàng)面，外用無菌敷貼纏繞包扎，每天換藥一次。

(2)芪柏愈瘍油組(TG1組)給藥方法：碘伏消毒，局部清創(chuàng)后，用生理鹽水潤洗創(chuàng)面，將含有芪柏愈瘍油藥液的紗布濕敷于大鼠創(chuàng)面，外用無菌敷貼纏繞包扎，每天換藥一次。

(3)復(fù)方紫草油組(TG2組)給藥方法：碘伏消毒，局部清創(chuàng)后，用生理鹽水潤洗創(chuàng)面，將含有紫草油藥液的紗布濕敷于大鼠創(chuàng)面，外用無菌敷貼纏繞包扎，每天換藥一次。

圖1 IL-1β免疫組化染色結(jié)果(200×)

1.2.4 取材

在用藥后7、14天，將大鼠麻醉后，剪取大鼠創(chuàng)面組織(包括創(chuàng)面周圍正常皮膚組織)，將組織置于無菌細胞凍存管中，于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80 0C冰箱中保存，用于免疫組化檢測。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間方差齊采用LSD法，方差不齊采用Tamhane's T2(M)法，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。繪圖采用Graphpad 7.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測創(chuàng)面組織中IL-1β的表達情況

用藥后7、14天，與空白對照組(NC組)大鼠相比，糖尿病各組(MG組、TG1組和TG2組)大鼠創(chuàng)面組織中IL-1β表達水平明顯增加(P＜0.05)，芪柏愈瘍油組(TG1組)與復(fù)方紫草油組(TG2組)大鼠創(chuàng)面組織中IL-1β表達水平明顯低于MG組(P＜0.05)，TG1組和TG2組未見明顯差異。見圖1、2。

圖2 IL-1β陽性目標(biāo)面密度值比較

3 討論

研究表明在糖尿病足潰瘍創(chuàng)面中IL-1β處于持續(xù)高表達的狀態(tài)，導(dǎo)致創(chuàng)面炎癥反應(yīng)異常[5,6]，是已知的最強的促炎細胞因子之一。IL-1β與其I型受體結(jié)合后，不但能增加自身的表達，形成自我放大的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，還能夠促進多種靶蛋白的磷酸化，促使NF-κB入核，增強促炎因子的表達，使炎癥細胞浸潤異常增多，放大炎癥反應(yīng)，并且持續(xù)較長時間，損傷血管內(nèi)皮細胞，使創(chuàng)面修復(fù)停滯不前，阻斷IL-1β被明，創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的吸收與消散明顯加快，順利過渡到增殖期，從而促進創(chuàng)面愈合[8]。

此次研究中發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面組織中出現(xiàn)炎癥細胞浸潤增加，消退延遲的病理現(xiàn)象，經(jīng)檢測創(chuàng)面組織發(fā)現(xiàn)IL-1β等炎性細胞因子異常分泌。模型組(MG組)大鼠潰瘍創(chuàng)面在7天時炎癥反應(yīng)最重，14天時仍存在較多炎性細胞，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)消退延遲的現(xiàn)象。用藥后，芪柏愈瘍油組(TG1組)與復(fù)方紫草油組(TG2組)大鼠創(chuàng)面組織中IL-1β的表達水平較模型組明顯降低，在藥物干預(yù)后的7天到14天炎性細胞因子的表達水平不斷降低，炎癥反應(yīng)逐漸消退，使創(chuàng)面微環(huán)境得到改善，從而促進創(chuàng)面的愈合。