楊照康，吳啟云，袁易輝，蔡苗珍，薛紅，張林，李若照，翁檸*

(1.貴州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，貴州 貴陽；2.貴州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽)

0 引言

癲癇的發(fā)生與大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電所致的大腦功能障礙相關，表現(xiàn)為發(fā)作性運動、自主神經(jīng)、感覺、意識、精神障礙[1]。目前治療癲癇的方法較多，雖可改善癲癇癥狀，但效果不佳，天麻素是在天麻中所提取的一種有效成分，具有較強的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗癲癇的作用，經(jīng)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用[2]?；诖耍诒疚难芯恐袠嫿ㄎ焖牡掳B大鼠模型，分析天麻素對致癇模型大鼠mTOR、caspase-9的調(diào)節(jié)作用及對大鼠行為學、海馬區(qū)病理結構的影響，為臨床上癲癇的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

研究動物：選取120只Wistar雄性大鼠，體重為180-240g，所有大鼠均購自三峽大學動物實驗中心，合格證號：SCXK(鄂)2017-0012，單籠飼養(yǎng)，自由飲水、進食，在相對濕度30%-35%、溫度為(23.8±1.5)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1周，光照12h/d。本研究獲我院倫理委員會批準。

主要試劑：戊四氮、天麻素(美國Sigma公司)；ATG7、mTOR、caspase-9 PCR試劑盒(武漢微克賽思科技有限公司 )。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模

將120只大鼠隨機分為正常組(A組)、模型組(B組)、天麻素小劑量組(C組)、天麻素中劑量組(D組)、天麻素大劑量組(E組)、丙戊酸鈉組(F組)各20只。B組、C組、D組、E組、F組使用戊四氮造模，均腹腔注射戊四氮(PTZ)亞驚厥劑量32mg/kg·d，使用前1h用生理鹽水配制成溶液，濃度為2.5mg/l，每日清晨注射一次，連續(xù)注射28d。每次給藥后觀察30min；停藥7d后，用同樣的方法點燃，1次/d，連續(xù)5d。凡連續(xù)4次出現(xiàn)2級以上發(fā)作或者連續(xù)出現(xiàn)2次5級發(fā)作即判定該鼠被慢性點燃。

1.2.2 給藥

各組繼續(xù)每日予維持量PTZ(20mg/kg.d)腹腔注射，使其保持癲癇狀態(tài)，B組在腹腔注射PTZ前2h腹腔注射生理鹽水。C組、D組、E組在維持量腹腔注射PTZ前2h腹腔注射天麻素，天麻素劑量按大鼠平均體重200g/只計算，分別予小劑量 (30mg/kg)、中劑量 (60mg/kg)、大劑量 (120mg/kg)天麻素；F組在維持量腹腔注射PTZ前2h腹腔注射丙戊酸鈉(VPA)，按成人劑量(20mg/kg·d)等效換算成大鼠劑量為120mg/kg·d。

1.2.3 行為學觀察

記錄各組大鼠驚厥發(fā)生率(TSR)、癇性發(fā)作潛伏期(ESL)、強直性驚厥潛伏期(TCL)情況。

1.2.4 樣本采集

使用10%的水合氯醛注射于大鼠腹腔做麻醉處理后迅速取海馬組織，分為均勻2等份，其中1份做海馬神經(jīng)細胞分離，另外1份在液氮中保存用于后續(xù)檢測。

1.2.5 病理組織學觀察

取1份海馬組織切片行HE染色處理，于顯微鏡下觀察大鼠海馬組織病理變化。

1.2.6 ATG7、mTOR、caspase-9表達量檢測

將液氮中保存的海馬組織，加入1mL Trizol研磨為粉末狀，提取總RNA，檢測RNA純度、含量，使用Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設計引物序列，RT-PCR法檢測ATG7、mTOR、caspase-9表達量，采用2-△△Ct計算。以GAPDH作為內(nèi)參。ATG7引物序列：上 游：5’-GTGTACGATCCCTGTAACCTAACCC-3’，下游：5’-CGAAAGCAGAGAACTTCAACAGACT-3’。mTOR引物序列：上游：5’-CAGTTCGCCAGTGGACTGAAG-3’，下游：5’-GCTGGTCATAGAAGCGAGAC-3’。caspase-9 引 物序 列：上 游：5’-ATACACCCTGGACTCGGATCC-3’，下 游：5’-TGCTGAAGCTTCTCACAGTCC-3’。 內(nèi) 參 基 因 GAPDH引物序列：上游：5’-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3’，下游：5’-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3’。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 六組大鼠行為學對比

如表1所示，C組、D組、E組、F組TSR低于B組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；E組、F組TSR低于C組、D組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；E組、F組TSR比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。C組、D組、E組、F組ESL、TCL高于B組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；E組、F組ESL、TCL高于C組、D組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；E組、F組EST、TCL比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

表1 六組大鼠行為學對比(±s)

表1 六組大鼠行為學對比(±s)

注：與 B組相比，bP＜0.05；與 C組相比，cP＜0.05；與 D組相比，dP＜0.05。

組別 只數(shù) TSR(n,%) ESL(min) TCL(min)A組 20 0 - -B 組 18 18(100.00) 10.12±0.98 20.86±1.09 C 組 18 13(72.22)b 13.20±1.03b 24.46±2.03b D 組 19 12(63.16)b 16.34±2.00bc 28.65±2.02bc E 組 19 5(26.32)bcd 25.34±3.46bcd 36.49±3.66bcd F 組 19 6(31.58)be 24.31±3.98bcd 35.12±2.13bcd

2.2 各組大鼠病理組織觀察

如圖1所示，正常組大鼠海馬結構、形態(tài)正常，細胞排列較為整齊，細胞核、核仁大小正常，著色均勻；模型組大鼠海馬結構改變，細胞核固縮、核仁變小，著色不一，神經(jīng)元壞死數(shù)量較多；天麻素低、中劑量組細胞排列、皺縮、細胞核固縮程度與模型組相比減輕。天麻素高劑量組及丙戊酸鈉組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元海馬結構有較輕的損傷現(xiàn)象，神經(jīng)元存活數(shù)目增多。

圖1

2.3 六組大鼠海馬神經(jīng)細胞自噬相關蛋白ATG7表達量比較

如表2所示，B組、C組、D組、E組、F組ATG7表達量高于A組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；C組、D組、E組、F組ATG7表達量低于B組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；E組、F組ATG7表達量低于C組、D組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；E組、F組ATG7表達量比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

表2 六組大鼠海馬神經(jīng)細胞自噬相關蛋白ATG7表達量比較(±s)

表2 六組大鼠海馬神經(jīng)細胞自噬相關蛋白ATG7表達量比較(±s)

注：與A組相比，aP＜0.05；與 B組相比，bP＜0.05；與C組相比，cP＜0.05；與 D 組相比，dP＜0.05。

組別 只數(shù) ATG7 A組 20 0.38±0.15 B組 18 1.98±0.69a C組 18 1.32±0.16ab D組 19 1.02±0.68abc E組 19 0.61±0.38abcd F組 19 0.62±0.31abcd

2.4 六組大鼠mTOR、caspase-9表達量比較

如表4所示，B組、C組、D組、E組、F組mTOR、caspase-9表達量高于A組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；C組、D組、E組、F組mTOR、caspase-9表達量低于B組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；E組、F組mTOR、caspase-9表達量低于C組、D組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；E組、F組mTOR、caspase-9表達量比較，無統(tǒng)計學差異 (P＞0.05)。

表4 六組大鼠mTOR、caspase-9表達量比較(±s)

表4 六組大鼠mTOR、caspase-9表達量比較(±s)

注：與A組相比，aP＜0.05；與 B組相比，bP＜0.05；與C組相比，cP＜0.05；與 D 組相比，dP＜0.05。

組別 只數(shù)(n) mTOR caspase-9 A 組 20 0.34±0.05 0.22±0.06 B 組 18 1.72±0.68a 1.89±0.49a C 組 18 1.29±0.38ab 1.34±0.62ab D組 19 1.00±0.11abc 1.02±0.35abc E 組 19 0.61±0.12abcd 0.51±0.22abcd F 組 19 0.65±0.19abcd 0.53±0.23abcd

3 討論

癲癇較為復雜，表現(xiàn)為反復發(fā)作的特點，目前已成為一種慢性疑難頑癥，常規(guī)西醫(yī)治療效果不佳，因此尋找有效治療此病的藥物對修復癲癇患者受損神經(jīng)元、促進疾病恢復具有重要的意義。

天麻素是從蘭科植物天麻中所提取的一種提取物，是天麻的重要有效成分，經(jīng)調(diào)節(jié)大腦皮層興奮、抑制過程間平衡失調(diào)發(fā)揮其鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、安眠的作用，發(fā)揮神經(jīng)病理損傷保護、抑制神經(jīng)細胞凋亡[3]。另外天麻素還可緩解腦血管痙攣、增加心腦血流量、清除機體過多對的自由基、改善體液免疫、細胞免疫[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5]，天麻素可抑制戊四唑誘導的癲癇模型陣攣性驚厥癥狀。本文研究發(fā)現(xiàn)，天麻素可延長ESL、TCL，降低驚厥發(fā)生率，模型組大鼠海馬結構改變，細胞核固縮、核仁變小，著色不一，神經(jīng)元壞死數(shù)量較多；天麻素低劑量和中劑量組細胞排列、皺縮、細胞核固縮程度與模型組相比減輕。天麻素高劑量組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結構有較輕的損傷現(xiàn)象，說明天麻素具有抗驚厥作用，可改善模型大鼠行為學及癲癇大鼠海馬區(qū)病理結構。

自噬是與細胞分化、存活、凋亡相關，與細胞凋亡相互拮抗、促進，在癲癇的發(fā)生發(fā)展中具有雙重的作用，低水平的自噬可保護神經(jīng)元，高水平自噬可損傷神經(jīng)元[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，自噬調(diào)節(jié)屬于一種較為復雜的過程，其中包括PI3K、mTOR、Ca2+、自噬相關蛋白ATG7等均與自噬相關，在自噬過程中發(fā)揮不同的作用。mTOR屬于一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于胞內(nèi)中心信號調(diào)節(jié)因子，與細胞增殖、凋亡、自噬、免疫抑制、蛋白質(zhì)翻譯等等生物學功能相關，其主要作用為調(diào)節(jié)細胞生長、細胞自噬、細胞凋亡等[8]。本文結果顯示，天麻素可抑制癲癇大鼠海馬神經(jīng)細胞自噬，其作用機制可能與抑制mTOR、自噬相關蛋白表達相關。

研究顯示[9]，隨著癲癇的不斷進展，海馬神經(jīng)細胞凋亡愈發(fā)加劇，caspase家族屬于一組半膀氨酸蛋白酶，可經(jīng)介導和執(zhí)行死亡指令參與細胞凋亡凋亡，caspase-9屬于此家族成員之一，屬于啟動分子，可啟動線粒體通路，介導凋亡的發(fā)生。臨床研究發(fā)現(xiàn)[10]，戊四氮所致的癲癇可激活caspase-9，使其參與癲癇持續(xù)狀態(tài)的細胞凋亡中，與癲癇患者神經(jīng)元損傷相關。本文結果顯示，天麻素可抑制癲癇大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡，其作用機制可能與抑制caspase-9表達相關。

綜上所述，天麻素能改善戊四氮致癇模型大鼠行為學指標以及海馬區(qū)病理結構，其作用機制可能與調(diào)控mTOR、caspase-9等表達，調(diào)控凋亡及自噬相關，為抗癲癇治療提供研究思路。