蔣 錦，陸培春，劉 琴，徐 靜

（江蘇大學附屬醫(yī)院麻醉科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

頸椎?。╟ervical spondylosis）是一種常見病、多發(fā)病，導致脊柱內外組織結構平衡失調并刺激或壓迫周圍組織結構（血管、神經(jīng)根、交感神經(jīng)和脊髓），進而誘發(fā)一系列癥狀，如頭痛、肩背疼痛、麻木、無力感等。其多歸因于頸椎間盤退變、頸椎骨質增生以及頸部外傷勞損或先天骨發(fā)育異常。頸椎病近年來發(fā)病率逐年升高，預防和治療頸椎病已成為全球共同關注和解決的問題之一。神經(jīng)根型頸椎病（cervical spondylotic radiculopathy，CSR）是頸椎病的常見表型[1，2]；神經(jīng)根性疼痛是CSR患者的典型癥狀[3]。CSR的發(fā)病可歸因于頸椎間盤突出、椎后小關節(jié)增生退變壓迫背根神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)根[4，5]。

JAK是一類胞質內非受體型可溶性酪氨酸蛋白激酶。該家族四大成員中的JAK1、JAK2和TYK2廣泛存在于各種組織和細胞中，而另一成員JAK3僅存在于骨髓和淋巴系統(tǒng)[6]。此外，STAT是一種能夠結合于DNA的獨特蛋白家族，發(fā)揮轉錄調控作用[7]。JAK/STAT負調節(jié)主要涉及以下三個負調節(jié)因子:細胞因子信號轉導抑制蛋白（suppressors of cytokine signaling，SOCS）、活化STATs蛋白抑制因子、蛋白酪氨酸磷酸酶[8]。其中SOCS家族是1997年以來發(fā)現(xiàn)的JAK/STAT信號轉導通路負調控因子，其成員包括CIS和SOCS1-7。SOCS1和SOCS3是SOCS家族中的重要成員，是先天性和適應性免疫應答關鍵性生理調節(jié)因子，參與廣泛的生物學過程。此外，二者也是JAK激酶和STAT信號轉導通路中重要抑制因子[9]，通過負性調節(jié)阻止細胞的惡性轉化及凋亡抑制。研究[10]發(fā)現(xiàn)，SOCS3與STAT3在胃癌組織中的表達呈負相關性。

此外，眩暈方是基于半夏白術天麻湯加減的經(jīng)驗方[11]，包括藥物當歸、川芎、丹參、葛根、白芍、熟地、白術、茯苓、澤瀉、菖蒲、磁石、桂枝。該自擬方在活血通絡、改善微循環(huán)缺血、除煩安神、中樞鎮(zhèn)驚鎮(zhèn)疼、抑制急性炎癥水腫等方面作用顯著。鑒于此，本研究基于JAK-STAT/SOCS負反饋調節(jié)信號通路探討眩暈方對CSR大鼠鎮(zhèn)痛作用的機制研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

本實驗動物為購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司的Sprague-Dawley健康雄性大鼠（66只，6周齡，體重160～200 g），飼養(yǎng)于SPF級動物室。所有實驗大鼠均飼養(yǎng)于恒溫、恒濕環(huán)境，使用人工照明，每天白天12 h，夜間12 h（08:00～20:00），允許自由飲水及進食。適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法，將66只大鼠隨機分為假手術組（正常對照）、模型組（CSR大鼠模型構建）、治療組（我院自擬眩暈方藥物治療），每組22只。

1.2 實驗造模

腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉大鼠。俯臥位固定，常規(guī)消毒后，手觸下頸部附近最高棘突（T2），以第2胸椎棘突為標記，以頸7為中心，沿棘突縱行切開皮膚及皮下組織、頸后部肌群，直至C6～T2椎弓充分暴露，暴露棘突及兩側椎板，用眼科剪刀剪斷頸6-7兩側橫突以上椎板，暴露出椎管內脊髓，顯露出左側頸6、7神經(jīng)根，使用尼龍漁線（約1.5cm長，直徑0.5mm）誘導頸神經(jīng)根炎癥，建立CSR模型。術后常規(guī)慶大霉素注射，連續(xù)3天。假手術組動物僅鉗開C7椎板，暴露脊髓，無插線處理。手術完成后，待動物于SPF恒溫房內蘇醒。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠干預方法假手術組:正常飲食和飲水，無任何干預處置。造模后第3天開始干預，模型組每日抓取1次，無藥物干預處置；治療組予以我院自擬眩暈方，藥物如下:當歸15g、川芎12g、丹參15g、葛根12g、白芍15g、熟地15g、白術15g、茯苓12g、澤瀉18g、菖蒲9g、磁石15g、桂枝6g。水煎至200mL，分為兩袋，早晚餐后半小時各1袋。

1.3.2 實驗動物行為和體征觀察CSR大鼠模型建立后，觀察行為學變化，如大鼠的精神狀態(tài)、體重變化、活動度、關節(jié)腫脹度、毛色毛質、死亡情況等。

1.3.3 機械痛閾測定和步態(tài)評估干預7天后，采用YLS-3E型痛分析儀對各組大鼠進行機械痛閾測定。同時，觀察大鼠行走及休息時的步態(tài)，參照Kawakami等法對大鼠疼痛所致步態(tài)障礙進行評估，采用計分制（1分=正常步態(tài)、足無畸形；2分=正常步態(tài)，伴足內收蜷縮畸形；3分=輕度步態(tài)障礙；4分=嚴重步態(tài)障礙）。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法檢測各組大鼠IL-6、PGE2含量干預7天后，采用10%水合氯醛麻醉大鼠致死，取壓線處脊髓及神經(jīng)根組織，制成組織勻漿。按ELISA試劑盒操作方法，采用ELISA法分別檢測IL-6、PGE2含量。反應結束后30min內，采用酶標儀在450nm處讀取OD值。

1.3.4 免疫共沉淀法檢測SOCS1與JAK1、SOCS3與STAT3蛋白相互作用如上述操作，取組織制成組織勻漿。離心后加入RIPA裂解液裂解細胞，冰上賦予后低溫離心10min；取上清液，加入SOCS與JAK1、SOCS3與STAT3抗體，4℃孵育過夜。免疫共沉淀法檢測SOCS1與JAK1、SOCS3與STAT3蛋白相互作用。

1.4 統(tǒng)計學分析

本研究基于SPSS 21.0統(tǒng)計軟件（SPSS Inc，Chicago，USA）進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)采用平均值±標準差的數(shù)據(jù)表示形式，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠動物行為和體征觀察

假手術組大鼠精神良好，進食良，喜動，活動靈活，反應敏捷，皮毛光亮，舌質淡紅，尾色正常，足爪未見腫脹，體重增長平穩(wěn)。造模后觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠進食明顯減少，活動量減低，反應遲鈍，毛發(fā)暗淡無光，雙后足腫脹、潰爛，走路微跛，觸碰時躲避并嘶叫伴弓背蜷縮，體重增加不顯著。而治療組大鼠毛色光澤及進食量均較前改善，活動量增加，雙后足腫脹潰爛及跛行癥狀減輕，體重增長恢復平穩(wěn)。

2.2 各組大鼠機械痛閾測定

組間檢驗結果提示:相比假手術組，模型組大鼠機械痛閾下降，差異有統(tǒng)計學意義；而相比模型組，治療組大鼠機械痛閾升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（見表1）。

表1 各組大鼠機械痛閾測定對比

2.3 各組大鼠步態(tài)評分比較

組間檢驗結果提示:相比假手術組，模型組大鼠步態(tài)評分升高，差異有統(tǒng)計學意義；而相比模型組，治療組大鼠步態(tài)評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（見表2）。

表2 各組大鼠步態(tài)評分對比

2.4 ELISA法檢測各組大鼠IL-6、PGE2含量

與假手術組相比:模型組IL-6和PGE2水平均顯著提升，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而相比模型組，治療組IL-6和PGE2水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（見表3）。

表3 各組大鼠IL-6、PGE2含量對比

2.5 免疫共沉淀法檢測SOCS1與JAK1、SOCS3與STAT3蛋白相互作用

SOCS1和STAT3抗體的免疫沉淀細胞裂解液中條帶與input陽性對照細胞液中的條帶一致，存在JAK1；而陰性對照液細胞裂解液中未出現(xiàn)特異性條帶，不存在JAK1和SOCS3；提示JAK1和SOCS3的成功表達。以上結果說明通過SOCS1抗體沉淀的細胞裂解液中含有JAK1，STAT3抗體沉淀的細胞裂解液中含有SOCS3，因此SOCS1與JAK1、SOCS3與STAT3存在結合。

3 討論

本研究之初已發(fā)現(xiàn)炎癥因子的介導在CSR急性期根性疼的發(fā)生、發(fā)展和緩解中有重要意義[12]。采用頸椎插線法構建CSR大鼠模型，可準確反映頸神經(jīng)根炎癥反應的變化過程，且方法簡單，結果可靠，實驗周期短，可重復性好。此外，眩暈方是基于半夏白術天麻湯加減的經(jīng)驗方，具有行氣活血通絡功效。該項研究從JAK-STAT/SOCS負反饋調節(jié)信號通路的新思路出發(fā)，構建大鼠CSR模型，重點脊髓組織中SOCS1-JAK1、SOCS3-STAT3蛋白相互作用的檢測，探討眩暈方對CSR的治療意義，以期提出新型治療理論以指導眩暈方的臨床應用，為闡明眩暈方對大鼠鎮(zhèn)痛作用的機制提供臨床循證依據(jù)。

本研究將66只大鼠適應性喂養(yǎng)7天，用隨機數(shù)字表法抽取22只分為假手術組、造模組、治療組。各組大鼠動物行為和體征觀察結果顯示，相比假手術組大鼠行為和體征表現(xiàn)正常，造模后大鼠進食明顯減少，活動量減低，反應遲鈍，毛發(fā)暗淡無光，雙后足腫脹、潰爛；而治療組大鼠毛色、進食量、活動量、雙后足腫脹、和體重均明顯恢復，初步提示眩暈方在改善CSR大鼠癥狀的作用。隨后本研究進一步評估并對比各組大鼠機械痛閾和步態(tài)評分結果，提示相較假手術組，模型組大鼠機械痛閾下降、步態(tài)評分升高，而治療組大鼠機械痛閾升高、步態(tài)評分降低。為明晰其作用機制，本研究采用ELISA法檢測各組大鼠IL-6、PGE2含量。ELISA具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優(yōu)點。其測定的對象可以是抗體也可以是抗原，故在本實驗中檢測IL-6、PGE2具有可行性。結果提示與假手術組相比，模型組呈上升趨勢，而與模型組相比，治療組前述指標呈下降趨勢。同時，免疫共沉淀是確定兩蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。本實驗中檢測SOCS1-JAK1和SOCS3-STAT3蛋白相互作用可采用此方法。結果發(fā)現(xiàn)SOCS1抗體沉淀的細胞裂解液中含有JAK1，STAT3抗體沉淀的細胞裂解液中含有SOCS3，提示SOCS1與JAK1、SOCS3與STAT3存在結合。

就其機制而言，JAK-STAT信號通路在發(fā)揮信號轉導作用的同時，可發(fā)揮負反饋調節(jié)功能，調控通路平衡[13]。SOCS是JAK/STAT的負調節(jié)的主要負調節(jié)因子。本院自擬眩暈方中川芎行氣活血通絡[14]；葛根有退熱、升陽、生津作用；當歸補血活血通絡[15]；丹參養(yǎng)血活血通絡，除煩安神，并鎮(zhèn)驚鎮(zhèn)疼；白芍養(yǎng)血斂陰，平抑肝陽。白術、云苓、澤瀉相配，健脾利水、消腫降濁功能增強；菖蒲開竅醒神，化濕和胃，寧神益智；磁石鎮(zhèn)驚安神，平肝潛陽，兩藥相配安神作用增強。桂枝溫陽通脈，其與白芍相合，可強心利尿鎮(zhèn)靜。因此，該方機制可能與降低炎性因子IL-6、PGE2含量，依賴SOCS負反饋調節(jié)因子調控JAK-STAT信號通路相關。

本研究創(chuàng)新性地基于JAK-STAT/SOCS負反饋調節(jié)信號通路，來討論眩暈方對CSR大鼠鎮(zhèn)痛作用的機制研究，JAK/STAT信號通路是一條重要信號轉導途徑，而SOCS家族主要作用在于負反饋調節(jié)該通路。本研究通過探論眩暈方對以上通路的作用，為緩解CSR患者的疼痛提供新思路。

綜上所述，眩暈方能夠對CSR大鼠具有明顯鎮(zhèn)痛作用，其機制與JAK-STAT信號通路與SOCS的交互作用，進而降低炎癥因子水平相關。本研究為深入探討CSR分子治療途徑提供一定理論基礎。我們期望未來在動物實驗基礎上開展臨床實驗，促進下一步眩暈方生產的開展，造福CSR患者。