徐艷梅，熊 艷，黃 杰，許 琛，汪 磊，趙 夏，張璐璐，許傳文

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 武漢 430030）

糖尿病是我國最為常見的慢性病之一，老年人群為主要發(fā)病群體[1，2]。我國人口老齡化現(xiàn)象不斷加重，糖尿病發(fā)病率一直居高不下。糖尿病癥狀的發(fā)生發(fā)展會引起一系列的并發(fā)癥，其中糖尿病腎病是較為常見的糖尿病合并癥，主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿、慢性高血糖，病情嚴重的會發(fā)展成為終末期腎臟病[3，4]。腎康注射液是治療糖尿病腎病以及其他腎臟疾病的中藥制劑，具有一定的臨床治療效果。有學者通過臨床研究表明，腎康注射液能夠改善糖尿病腎病患者腎功能以及脂代謝紊亂狀況，從而達到治療目的。但是腎康注射液具體作用機制還未研究透徹。本研究建立糖尿病腎病大鼠模型，使用腎康注射液進行干預(yù)，觀察效果。

1 材料與方法

1.1 材料

選取60只SD健康雄性大鼠，由吉林大學動物實驗中心提供，年齡3～5月，平均（4.1±0.7）月；體重220～234g，平均體重（226.9±4.7）g。在相對濕度50%～55%、溫度（24.1±2.1）℃的環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠1周，光照12h/天。本文研究獲我院倫理委員會批準。

主要試劑:腎康注射液（西安世紀盛康藥業(yè)有限公司，國藥準字Z20040110，規(guī)格:20mL/支）；鏈脲佐菌素（Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模 參照蘇衍進[5]等研究中建模方法并作出適當改動，進行糖尿病腎病模型建立。按隨機數(shù)字表法將所有大鼠分為正常組、糖尿病組、低劑量組、高劑量組四組各15只。對所有大鼠隔夜禁食16h，糖尿病組、低劑量組、高劑量組大鼠一次性腹腔注射60mg/kg STZ，正常組大鼠注射等量生理鹽水。5天后檢測大鼠血糖，血糖＞16.7mmol/L視為糖尿病模型建模成功。分別使用2g/kg、4g/kg的腎康注射液對低、高劑量組大鼠進行干預(yù)，正常組、糖尿病組大鼠使用等量生理鹽水進行干預(yù)，所有大鼠均連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.2 TG、TC水平檢測 取各組大鼠尾部靜脈血2mL，2000r/min離心處理15min后分離上清液，在-80℃環(huán)境中保存待檢。膽固醇氧化酶法檢測TC水平:準備3個試管并分別標記為標準管、測定管及空白管，標準管中添加50μL膽固醇標準液、1.5μL酶試劑；測定管中添加50μL血清、1.5μL酶試劑；空白管中添加50μL蒸餾水、1.5μL酶試劑。3個試管分別搖晃均勻，常溫環(huán)境靜置5～10min后使用分光光度計進行比色，在500nm波長處以空白管調(diào)零，記錄吸光度，并對血清TC水平進行計算。脂肪酶法檢測TG水平:使用脂肪酸對甘油三酯進行水解，并使用甘油激酶對生成的甘油進行催化，生成3-磷酸甘油后使用甘油磷酸氧化酶進行催化，對血清TG水平進行計算。

1.2.3 FBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR水平檢測 使用血糖檢測儀對各組大鼠FBG、HbA1c水平進行檢測，檢測FINS水平，對HOMA-IR水平進行計算，計算公式:HOMA-IR=FINS（國際單位/L）×空腹葡萄糖（mmol/L）/22.5。

1.2.4 散射比濁法檢測β2-MG、CYS-C、SCr、BUN水平 對提取的待測標本在凝固的過程中發(fā)生變化的散射光確定檢測，在光探檢測器為九十度直角的單色光源中向血清樣本加凝血激活劑，在樣品凝塊的過程中，散射光的強度會慢慢增加，當血清樣本完全凝固后，光探測器會發(fā)生變化，會送到檢測器上處理并且描出凝固曲線后檢測β2-MG、CYS-C、SCr、BUN水平的變化。

1.2.5 腎重指數(shù)檢測 對所有大鼠體重進行統(tǒng)計，之后對四組大鼠進行全麻處理，采用斷頭法處死，將大鼠腎組織取出，稱取大鼠腎重量，并對腎重指數(shù)進行計算。

1.2.6 HE染色處理 將大鼠腎組織固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24h后行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片。首先將切片烤干后進行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中各復(fù)水3min。使用蘇木精染色15min后清洗三次，使用鹽酸酒精分化處理30s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用酒精進行脫水處理后進行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進行觀察。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TGF-β1、CTGF、FN、COL-IV、α-SMA、MDA、SOD、ROS水平 將血清置于室溫后，標記酶標板，制作標準品，然后取出試劑盒，以一比二的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋好的待測血清和標準品100μL/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2h；然后用專用的洗滌液將反應(yīng)板清洗3次以后，再加入抗體工作液（1:100倍稀釋后）100μL/孔，放于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液100μL/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100μL/孔終止反應(yīng)，在450nm波長測定吸光度，經(jīng)繪制標準曲線計算ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TGF-β1、CTGF、FN、COL-IV、α-SMA、MDA、SOD、ROS水平。

1.2.8 RhoA、ROCK1表達檢測 蛋白質(zhì)印跡法檢測RhoA、ROCK1表達:取150℃Ripa裂解液，1.5℃PMSF冰中孵育30min，4c1500r/min離心15min，取上清。每個樣品取15g蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)入PDVF膜，5%脫脂牛奶常溫下密封2h。加入抗體過夜。取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色，對RhoA、ROCK1相對表達量進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠生化指標水平比較

正 常 組 大 鼠FBG、FINS、TC、TG、HbA1c、HOMA-IR水平均低于其他三組，且糖尿病組大鼠FBG、FINS、TC、TG、HbA1c、HOMA-IR水平高于低、高劑量組，高劑量組大鼠FBG、FINS、TC、TG、HbA1c、HOMA-IR水平低于低劑量組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（見表1）。

2.2 四組大鼠血清β2-MG、CYS-C、SCr、BUN水平比較

正常組大鼠血清β2-MG、CYS-C、SCr、BUN水平均低于其他三組，且糖尿病組大鼠血清β2-MG、CYS-C、SCr、BUN水平高于低、高劑量組，高劑量組大鼠血清β2-MG、CYS-C、SCr、BUN水平低于低劑量組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（見表2）。

2.3 四組大鼠腎重及腎重指數(shù)比較

正常組大鼠腎重及腎重指數(shù)均低于其他三組，糖尿病組大鼠腎重及腎重指數(shù)高于低、高劑量組，且高劑量組大鼠腎重及腎重指數(shù)低于低劑量組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（見表3）。

表1 四組大鼠各項生化指標及胰島素抵抗水平比較（）

表1 四組大鼠各項生化指標及胰島素抵抗水平比較（）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與糖尿病組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05。下表同。

組別正常組糖尿病組低劑量組高劑量組F P FBG（mmol/L）4.69±0.72 29.11±3.15*20.03±3.08*#15.33±2.73*#△21.89＜0.05 FINS（μU/mL）15.63±2.26 36.88±4.25*31.62±4.11*#23.85±3.52*#△11.42＜0.05 TC（mmol/L）1.70±0.16 2.42±0.26*2.11±0.23*#1.92±0.19*#△5.15＜0.05 TG（mmol/L）0.94±0.10 3.08±0.42*2.21±0.29*#1.32±0.17*#△11.19＜0.05 HbA1c（%）5.01±0.12 10.98±1.23*8.22±0.85*#6.36±0.56*#△13.69＜0.05 HOMA-IR 1.10±0.05 14.36±2.55*11.16±2.31*#6.22±1.06*#△28.03＜0.05

表2 四組大鼠血清β2-MG、CYS-C、SCr、BUN水平比較（）

表2 四組大鼠血清β2-MG、CYS-C、SCr、BUN水平比較（）

組別正常組糖尿病組低劑量組高劑量組β2-MG（mg/L）2.21±0.23 6.61±0.86*5.13±0.64*#3.65±0.51*#△14.95＜0.05 CYS-C（mg/L）0.67±0.27 4.02±0.76*2.98±0.63*#1.26±0.40*#△7.11＜0.05 SCr（mmol/L）38.54±3.56 86.97±7.55*71.33±6.32*#52.69±4.96*#△13.46＜0.05 F P BUN（mmol/L）6.77±0.85 26.88±2.68*20.53±2.41*#11.85±1.56*#△16.61＜0.05

表3 四組大鼠腎重及腎重指數(shù)比較（）

表3 四組大鼠腎重及腎重指數(shù)比較（）

組別正常組糖尿病組低劑量組高劑量組n 15 15 15 15 F P腎重（g）1.19±0.09 2.16±0.23*1.83±0.18*#1.56±0.14*#△22.82＜0.05腎重指數(shù)（×10-3）2.28±0.11 5.59±0.35*4.49±0.31*#3.36±0.24*#△23.77＜0.05

2.4 四組大鼠腎臟組織病理學觀察

正常組大鼠腎組織細胞排列整齊，細胞形態(tài)完整；糖尿病組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)、大小不規(guī)則，腎臟組織細胞排列較為紊亂，細胞外基質(zhì)增多；低、高劑量組大鼠腎小球略微肥大，結(jié)構(gòu)基本完整，腎臟組織細胞排列較為整齊（見圖1）。

2.5 四組大鼠腎組織細胞黏附分子、細胞因子水平比較

正常組大鼠腎組織ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TGF-β1、CTGF水平均低于其他三組，且糖尿病組大鼠腎組織ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TGF-β1、CTGF水平高于低、高劑量組，高劑量組大鼠腎組織ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TGF-β1、CTGF水平低于低劑量組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（見表4）。

表4 四組大鼠腎組織細胞黏附分子、細胞因子水平比較（）

組別正常組糖尿病組低劑量組高劑量組ICAM-1（μg/L）249.55±36.58 579.22±51.17*456.33±47.52*#336.85±40.23*#△30.45＜0.05 VCAM-1（mg/L）452.36±52.63 753.88±71.66*632.85±63.54*#546.21±57.32*#△19.70＜0.05 IL-6（pg/mL）78.63±8.55 365.21±36.54*253.78±30.16*#125.86±21.55*#△44.36＜0.05 TGF-β1（pg/L）465.22±20.54 894.36±46.32*731.33±42.15*#576.85±37.55*#△49.20＜0.05 F P CTGF（pg/L）92.33±20.11 245.36±35.61*205.21±30.52*#151.77±26.33*#△21.74＜0.05

2.6 四組大鼠腎組織纖維化指標及氧化應(yīng)激反應(yīng)指標水平對比

正常組大鼠腎組織FN、COL-IV、α-SMA、MDA、ROS水平均低于其他三組，SOD水平高于其他三組，且糖尿病組大鼠腎組織FN、COL-IV、α-SMA、MDA、ROS水平高于低、高劑量組，SOD水平低于低、高劑量組，高劑量組大鼠腎組織FN、COLIV、α-SMA、MDA、ROS水平低于低劑量組，SOD水平高于低劑量組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表5）。

表5 四組大鼠腎組織纖維化指標及氧化應(yīng)激反應(yīng)指標水品對比（）

表5 四組大鼠腎組織纖維化指標及氧化應(yīng)激反應(yīng)指標水品對比（）

組別正常組糖尿病組低劑量組高劑量組F P FN 85.11±6.35 247.36±15.22*200.35±13.49*#134.51±10.63 57.16＜0.05 COL-IV（μg/L）14.22±1.23 26.35±2.35*22.17±2.21*#18.33±1.86*#△26.57＜0.05 α-SMA（pg/mL）372.19±42.55 765.85±71.44*632.87±62.33*#492.36±50.26*#△27.50＜0.05 MDA（nmol/mL）1.15±0.06 2.64±0.23*2.13±0.16*#1.52±0.11*#△36.42＜0.05 SOD（U/mL）99.63±16.53 68.52±10.23*77.33±10.52*#87.36±12.21*#△9.30＜0.05 ROS（ng/L）351.64±32.65 476.52±45.21*423.11±43.06*#384.55±38.65*#△13.01＜0.05

2.7 腎康注射液對RhoA/ROCK信號通路相關(guān)蛋白相對表達量的影響

正常組大鼠腎組織RhoA、ROCK1相對表達量均低于其他三組，且糖尿病組大鼠腎組織RhoA、ROCK1相對表達量高于低、高劑量組，高劑量組大鼠腎組織RhoA、ROCK1表達低于低劑量組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）（見表6，圖2）。

3 討論

表6 腎康注射液對RhoA/ROCK信號通路相關(guān)蛋白相對表達量的影響（）

表6 腎康注射液對RhoA/ROCK信號通路相關(guān)蛋白相對表達量的影響（）

組別正常組糖尿病組低劑量組高劑量組只數(shù)（n）15 15 15 15 F P RhoA 1.00±0.01 1.85±0.08*1.67±0.06*#1.35±0.04*#△49.31＜0.05 ROCK1 1.00±0.01 1.78±0.07*1.53±0.06*#1.32±0.03*#△58.78＜0.05

TC、TG水平變化參與機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，二者水平異常變化能夠?qū)е聶C體炎癥介質(zhì)水平上調(diào)，促使機體血糖水平異常升高[6～8]。使用腎康注射液對糖尿病腎病模型大鼠進行干預(yù)后，TG、TC水平出現(xiàn)明顯下降，腎康注射液能夠有效控制糖尿病腎病大鼠TG、TC水平，進而改善大鼠內(nèi)皮受損程度以及氧化應(yīng)激反應(yīng)。FINS、HOMA-IR是兩種常見的胰島素指標，用于糖尿病癥狀的臨床檢測[9，10]。本研究顯示，使用腎康注射液進行干預(yù)，糖尿病腎病大鼠FINS、HOMA-IR水平下降，說明腎康注射液能夠有效控制糖尿病腎病大鼠FINS、HOMA-IR水平，改善大鼠胰島素抵抗狀況。

黏附分子是一種介導(dǎo)細胞與細胞之間、細胞與細胞質(zhì)之間黏附作用的膜表面糖蛋白，在機體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等病理過程中發(fā)揮重要作用[11]，VCAM-1、ICAM-1都是臨床常用的細胞黏附分子，VCAM-1主要介導(dǎo)單核細胞的粘附，ICAM-1主要分布在平滑肌細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞以及白細胞中，是介導(dǎo)黏附反應(yīng)重要的一個黏附分子[12，13]。有學者在研究中表示，糖尿病腎病癥狀的發(fā)展伴隨著炎癥反應(yīng)[14]，IL-6是臨床常用的炎癥因子，檢測IL-6水平能夠?qū)ρ装Y反應(yīng)嚴重程度進行評價[15]。TGF-β1是十分關(guān)鍵的促纖維化生長因子，有學者在研究中表明，TGF-β1在機體腎間質(zhì)纖維化形成過程中發(fā)揮著重要作用，此外，F(xiàn)N、COL-IV、α-SMA在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中也至關(guān)重要。本研究顯示，使用腎康注射液進行干預(yù)，糖尿病腎病大鼠VCAM-1、ICAM-1、IL-6、TGF-β1、FN、COL-IV、α-SMA水平受到明顯的下調(diào)，說明腎康注射液能夠通過調(diào)控大鼠VCAM-1、ICAM-1、IL-6、TGF-β1、FN、COL-IV、α-SMA水平，緩解糖尿病模型大鼠炎癥反應(yīng)以及腎間質(zhì)纖維化狀況，從而起到干預(yù)效果。

有學者在研究中表示，糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，使用腎康注射液對糖尿病腎病模型大鼠進行干預(yù)后，糖尿病腎病模型大鼠SOD、MDA、ROS水平受到明顯調(diào)控，說明腎康注射液能夠通過調(diào)控SOD、MDA、ROS水平而改善糖尿病腎病模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮干預(yù)效果。

大量實驗研究表示，糖尿病腎病發(fā)病與RhoA/ROCK信號通路的激活具有密切聯(lián)系。RhoA/ROCK信號通路主要包括RhoA、ROCK1，有學者在研究中表示，RhoA/ROCK信號通路能夠?qū)∏虻鞍琢姿崦傅幕钚赃M行調(diào)節(jié)，RhoA主要在細胞膜以及細胞質(zhì)中表達，并且能夠?qū)OCK1激活，使其在腎臟組織中大量表達。有學者在研究中提出，氧化應(yīng)激反應(yīng)與機體血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)，還有實驗研究表明慢性腎臟病患者活性氧類產(chǎn)物較高，而RhoA/ROCK信號通路的激活能夠調(diào)節(jié)機體活性氧類產(chǎn)物蓄積，從而下調(diào)eNOS，抑制NO生成，導(dǎo)致機體內(nèi)皮功能障礙。本研究顯示，使用腎康注射液進行干預(yù)，糖尿病腎病大鼠腎組織RhoA、ROCK1相對表達量受到明顯調(diào)控，說明腎康注射液能夠通過調(diào)控RhoA、ROCK1表達而對大鼠腎臟組織起到保護作用。

綜上所述，腎康注射液能夠改善糖尿病腎病大鼠胰島素抵抗及腎臟病變、細胞內(nèi)皮損傷、慢性炎癥、氧化應(yīng)激以及腎間質(zhì)纖維化狀況，RhoA/ROCK信號通路可能是腎康注射液對大鼠糖尿病腎病起到保護作用機制之一。