范 龍，王松海，邱麗莉，羅毓媛，張凱航

（1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院放射科，海南 海口 570311；2.?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院放射科）

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）[1，2]的逐漸沉積是導(dǎo)致肝纖維化進(jìn)展的重要途徑，而基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）可特異性降解ECM。MMPs家族中基質(zhì)金屬蛋白酶-1（matrixmetalloproteinase-1，MMP-1）廣泛存在于人體中[1，2]，被肝細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞等分泌，是組織肝纖維化進(jìn)展的主要蛋白酶原[3，4]。MMP-1在肝組織中的表達(dá)也可以客觀反映肝纖維化病理程度。

美國肝臟疾病研究協(xié)會指南上[5]提出F2期肝纖維化對臨床治療選擇上具有重要的意義。Ronot[6]等研究結(jié)果也支持中度肝纖維化是影響慢性肝病預(yù)后的重要一步。MRI-DWI目前已經(jīng)是較成熟的功能成像技術(shù)[7～10]，ADC值可在體量化評估肝纖維化，在分子生物學(xué)評估研究中具有一定的前景。本研究旨在研究輕中度肝纖維化肝臟ADC值變化與MMP-1 mRNA的表達(dá)相關(guān)性，為下一步MMP-1基因沉默干擾肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動物模型建立

實(shí)驗(yàn)大鼠來源于海南省實(shí)驗(yàn)動物中心，采用隨抽樣機(jī)法分為模型組和對照組。本研究中大鼠模型組總共32只，體質(zhì)量165～206g，造模采用腹腔注射豬血清（市場購買豬血、離心取血清）法[7]，劑量0.5mL/次，每周2次，食物亦購自海南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，常規(guī)自來水飲用。

1.2 MRI-DWI及后處理計(jì)算ADC值

MR檢查使用西門子3.0 T磁共振機(jī)（德國），專業(yè)實(shí)驗(yàn)動物線圈，后處理軟件[Function Tool（GE AW 4.4）]。技術(shù)掃描方案及參數(shù)參考戰(zhàn)躍福[7]等研究:掃描前6h禁止飲食、飲水，采用戊巴比妥鈉（1%）1.0 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉。為防止過度呼吸運(yùn)動及檢查室溫度過低采用自制棉帶腹部加壓固定，體位采用俯臥位，并調(diào)整肝臟位于線圈中心。MRI-DWI檢查b值=800 s/mm2，SE-EPI序列加脂肪抑制。掃描參數(shù)參考戰(zhàn)躍福等[7]研究:TR=3000 ms，TE=75.6 ms，層間距=0 mm，層厚=3.0 mm，NEX=8，F(xiàn)OV=100mmX100mm，矩陣=192×192。專配后處理工作站，取肝臟3個感興趣區(qū)取平均值[7]，距離肝包膜應(yīng)＞1.0cm，盡量避開肝內(nèi)膽管、肝臟血管等干擾。

1.3 肝臟組織病理學(xué)檢查（HE、Masson三色染色、網(wǎng)狀纖維染色）影像學(xué)檢查完成后過量麻醉劑處死大鼠，采用

4%多聚甲醛左心灌注固定以排除血液對組織學(xué)標(biāo)本的影響。盡量選擇影像肝臟感興趣區(qū)靶標(biāo)本取材，病理學(xué)檢查。病理結(jié)果判讀由病理科兩位高年資主治醫(yī)師以上判讀結(jié)果。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會共識[11]。因?yàn)楣沧R[11]中更加注重顯著肝纖維化的臨床意義（METAVIR≥S2或Ishak≥S3定義為顯著纖維化），因此本研究將S1期歸為輕度肝纖維化組，S2、S3期歸為中度肝纖維化組，

1.4 MMP-1 mRNA檢測

根據(jù)解剖學(xué)定位選取與肝臟DWI成像ROI相同區(qū)域肝臟組織進(jìn)行Real time PCR檢測。按總RNA試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）說明書提取肝臟總RNA。MMP-1、G3PDH Real Time-PCR擴(kuò)增引物（上海生工合成）根據(jù)Okamoto[12]、Wasser[13]設(shè)計(jì)。MMP-1，forward primer:（5’-TCG TGA GAA TGT CTT CCC ATT-3’），reverse primer:（5’-TCTTGGATTG ATTTGAGATAAGTGAAATC-3’）；G3PDH forward primer:5’CCC TTC ATT GAC CTC AAC TAC ATGG-3’，reverse primer:5’-CAT GGT GGT GAA GAC GCC AG-3’。Real-time-PCR根 據(jù)TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、SYBR Premix Ex Taq II說明書進(jìn)行檢測肝臟組織MMP-1表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件包，數(shù)據(jù)以表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析、SNK法、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝纖維化模型的建立及病理組織學(xué)檢查

模型組大鼠32只中，圖像不符合分析要求2只，最終符合輕度肝纖維化組11只，中度肝纖維化組15只。對照組8只大鼠均完成DWI檢查。

HE染色:S1期肝纖維化匯管區(qū)可見纖維增生（見圖3A），到中度肝纖維化則可出現(xiàn)橋接纖維化（見圖4A）；Masson三色染色:S1期肝纖維化膠原纖維可見染色（圖3B），到中度肝纖維化組藍(lán)染則增多（見圖4B）。網(wǎng)狀纖維染色:S1期肝纖維化可見黑褐色染色（見圖3C），到中度肝纖維化組黑褐色染色明顯增厚，并可出現(xiàn)小葉內(nèi)瘢痕（見圖4C）。

2.2 影像學(xué)及分子生物學(xué)結(jié)果（見表1）

表1 三組大鼠肝臟ADC值及MMP-1 mRNA相對表達(dá)量

2.3 三組大鼠肝臟ADC值及MMP-1 mRNA表達(dá)相關(guān)性

對照組、輕-中度肝纖維化組大鼠肝臟ADC值與MMP-1 mRNA表達(dá)Pearson相關(guān)系數(shù)為0.64（P＜0.05），結(jié)果提示呈正相關(guān)。

3 討論

3.1 肝纖維化分組及模型的選擇及意義

美國肝臟疾病指南上[5]也指出肝纖維化F2期被認(rèn)為具有重要的臨床意義；國外學(xué)者Ronot[6]等認(rèn)為中度肝纖維化是慢性肝病診斷和治療的重要階段。因此本研究根據(jù)指南及學(xué)者的研究[5，6]選擇輕-中度肝纖維化組的功能影像及分子生物學(xué)研究更具有臨床價值。本文采用的是免疫法豬血清腹腔注射造模，其肝纖維化形成過程雖然較長，但確是研究肝纖維化轉(zhuǎn)歸較可靠的模型[7，14，15]，為下一步MMP-1基因沉默干擾肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.2 影像學(xué)評估肝纖維化-肝硬化

目前超聲彈性成像雖已經(jīng)寫進(jìn)肝纖維化評估指南中，是目前比較可靠的影像學(xué)評估方法，但對操作者仍具有一定的要求，且普及并不是太廣，對基層醫(yī)院推廣價值仍有一定限制；CT灌注成像評估參數(shù)較多，評估價值也比較顯著，臨床應(yīng)用前景也非常廣泛，但輻射劑量仍是制約其全面推廣的主要原因；磁共振功能成像，如DWI，MRS，PWI，BOLD等多種影像技術(shù)方法，其中DWI應(yīng)用最為廣泛且最具有前景。ADC值雖已廣泛應(yīng)用于肝纖維化的研究[7～10]，且b值選取800 s/mm2普遍認(rèn)為圖像質(zhì)量清晰，評估能力最佳，但對于早中期肝纖維化的診斷價值尚有一定爭議。

3.3 MMP-1 mRNA表達(dá)在輕中度肝纖維化中的意義及ADC值反映MMP-1表達(dá)的能力

本文研究結(jié)果輕-中度肝纖維化MMP-1 mRNA表達(dá)呈下降趨勢，MMP-1廣泛存在于肝臟中，被肝細(xì)胞、枯否氏細(xì)胞等分泌，由輕度肝纖維化進(jìn)展為中度肝纖維化，肝臟炎性反映加重，MMP-1必然亦隨之減少[3，4]，因而MMP-1在肝組織中的表達(dá)水平可以真實(shí)反映肝纖維化程度。本文研究結(jié)果顯示輕度肝纖維化進(jìn)展為中度肝纖維化，大鼠肝臟DWI-ADC值同病理分期表達(dá)相一致，且同國內(nèi)外學(xué)者研究一致[7～10，15]，ADC降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是由于I、III型膠原纖維的增加，導(dǎo)致水分子彌散受限所致。

戰(zhàn)躍福[7]研究結(jié)果提示ADC值不能區(qū)分S1與S2期、S2與S3期，國內(nèi)范國華[8]研究結(jié)果也提示ADC值不能區(qū)分S2與S3期；有學(xué)者指出原因可能由于存在部分病例病理分期上的重疊；綜上所述ADC值在評估肝纖維化精度上確實(shí)存在較多的影響因素，仍有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示S1期與S2、S3期間肝臟ADC值及MMP-1 mRNA表達(dá)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雖然輕-中度組間仍有一部分病理分期存在重疊，但較戰(zhàn)躍福[7]、范國華[8]等研究在分組上更具有臨床探討價值。

3.4 研究不足及展望

第一本研究結(jié)果提示輕-中度肝纖維化大鼠肝臟ADC值與MMP-1表達(dá)呈正相關(guān)，但關(guān)于兩者是否具有相關(guān)性，需要下一步通過反義抑制MMP-1表達(dá)，再深入探討兩者之間的關(guān)系。第二難以精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)影像上感興趣區(qū)選擇與組織病理學(xué)標(biāo)本的完美對照，下一步擬引進(jìn)計(jì)算機(jī)信息學(xué)圖像分割方法予以解決。