魏 慧，張 卿

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科）

任何腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都依賴于血液供應(yīng)[1]，腫瘤血供豐富，營(yíng)養(yǎng)充分，導(dǎo)致腫瘤快速生長(zhǎng)、惡化、轉(zhuǎn)移。血管新生依賴于促血管生長(zhǎng)因子，目前促進(jìn)血管新生的生長(zhǎng)因子主要有bFGF、COX-2、TGF-β1等，它們能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖[2]，誘導(dǎo)腫瘤血管生成。肺癌是我國(guó)患病率最高的惡性腫瘤[3]，其中非小細(xì)胞肺癌最多見[4]，約75%～80%。

本研究前期實(shí)驗(yàn)表明:COX-2在肺腺癌中高表達(dá)，并可促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖[5]。目前，國(guó)內(nèi)外研究表明[6，7]，非甾體抗炎藥（NSAID）有抗腫瘤的作用，而且有協(xié)同傳統(tǒng)化療藥物發(fā)揮抗腫瘤作用。尤其選擇性COX-2抑制劑因其副作用小，已被應(yīng)用于結(jié)腸癌、直腸腺癌的臨床實(shí)驗(yàn)中[8]。

本研究旨在探討選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合順鉑的抗腫瘤作用，為肺癌提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肺癌細(xì)胞株A549，購(gòu)買于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所。試驗(yàn)動(dòng)物:4周齡雌性BALB/C裸鼠32只，體重16～18g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【試驗(yàn)裸鼠許可證號(hào)SCXK（京2012-0001）】。

1.2 測(cè)量瘤重、對(duì)肺癌A549裸鼠移植瘤組織內(nèi)血管生長(zhǎng)因子測(cè)定

瘤重抑制率=（對(duì)照組移植瘤重-用藥組瘤重）/對(duì)照組瘤重×100%；免疫組化檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)bFGF、COX-2、TGF-β1血管生長(zhǎng)因子。

1.3 結(jié)果判定

應(yīng)用免疫組織化學(xué)和形態(tài)計(jì)量方法，用CD31標(biāo)記微血管，置于顯微鏡下，計(jì)數(shù)采用微血管金標(biāo)準(zhǔn)法，COX-2陽(yáng)性染色定位于胞質(zhì)和胞膜染色，呈棕黃色著色，b-FGF、TGF-β陽(yáng)性染色定位于胞漿/胞質(zhì)染色，呈棕黃色彌漫著色。每個(gè)標(biāo)本切4張片子進(jìn)行染色，利用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)定。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)定法[9]:采用9分評(píng)分制，按照陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度分別計(jì)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)性檢驗(yàn)采用單樣本K-S擬合優(yōu)度法。計(jì)量資料以表示，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)。多個(gè)樣本間不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，數(shù)據(jù)間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建肺癌A549裸鼠移植瘤模型

裸鼠荷瘤過程順利，生長(zhǎng)狀態(tài)較好。移植瘤生長(zhǎng)過程中，開始裸鼠背部皮下形成圓形、橢圓形、不規(guī)則形結(jié)節(jié)，觸摸偏硬，早期腫瘤呈灰白色，表面光滑，之后腫瘤逐漸增大。荷瘤后第8天開始用藥，裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

2.2 NIM單獨(dú)以及聯(lián)合DDP對(duì)肺癌A549裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

用藥治療后測(cè)量肺癌A549裸鼠移植瘤的瘤重變化，第22天處死裸鼠剝離移植瘤，計(jì)算腫瘤瘤重抑制率。NIM+DDP組分別與NIM組、DDP組比較，NIM+DDP組瘤重抑瘤率最強(qiáng)（P＜0.001），總體之間比較F值32.264（見表1）。

表1 用藥結(jié)束后各組裸鼠移植瘤瘤重和瘤重抑瘤率（）Tab.1 Tumor weight and tumor weight inhibition rate of transplanted nude mice in each group after treatment()

表1 用藥結(jié)束后各組裸鼠移植瘤瘤重和瘤重抑瘤率（）Tab.1 Tumor weight and tumor weight inhibition rate of transplanted nude mice in each group after treatment()

注：NIM組與DDP組比較，P＜0.001；NIM組與NIM+DDP組比較，P＜0.001；DDP組與NIM+DDP組比較，P＜0.001。

Group Normal control NIM DDP NIM+DDP Tumor weight（g）1.11±0.18 1.01±0.12 0.73±0.07 0.58±0.06 32.264＜0.001 inhibit rate of tumor weigh（%）9.91 34.23 47.75 F P

2.3 NIM單獨(dú)以及聯(lián)合DDP對(duì)肺癌A549裸鼠移植瘤細(xì)胞COX-2、bFGF、TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 免疫組化測(cè)定COX-2在各組肺癌A549移植瘤中的表達(dá)COX-2陽(yáng)性染色定位于胞質(zhì)和胞膜染色，呈棕黃色著色，每個(gè)標(biāo)本切4張片子進(jìn)行染色，利用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)定。NIM+DDP組分別與對(duì)照組、NIM組、DDP組比較（P＜0.001），COX-2陽(yáng)性表達(dá)呈對(duì)照組＞NIM組＞DDP組＞NIM+DDP組?？傮w之間比較χ2值為45.486（見表2，圖1）。

表2 COX-2在各組肺癌A549移植瘤中的表達(dá)Tab.2 Expression of COX-2 in lung cancer A549 transplanted tumor in each group

2.3.2 免疫組化測(cè)定b-FGF在各組肺癌移植瘤中的表達(dá)每個(gè)標(biāo)本切4張片子進(jìn)行染色，利用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)定。b-FGF在各組肺癌A549移植瘤中的陽(yáng)性表達(dá)呈對(duì)照組＞NIM＞DDP＞NIM+DDP；而對(duì)照組與NIM組的陽(yáng)性表達(dá)，（P＞0.05），無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIM+DDP與DDP組、對(duì)照組、NIM組的陽(yáng)性表達(dá)（P＜0.001）。四組之間總體比較χ2值為44.238（見表3、圖2）。b-FGF陽(yáng)性染色定位于胞漿/胞質(zhì)染色，呈棕黃色彌漫著色。NIM+DDP組的陽(yáng)性表達(dá)最弱（見圖2）。

表3 b-FGF在各組肺癌A549移植瘤中的表達(dá)Tab.3 Expression of b-FGF in lung cancer A549 transplanted tumor in each group

2.3.3 TGF-β免疫組化測(cè)定在各組肺癌移植瘤中的表達(dá)每個(gè)標(biāo)本切4張片子進(jìn)行染色，利用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)定。TGF-β在各組肺癌A549移植瘤中的陽(yáng)性表達(dá)呈對(duì)照組＞NIM＞DDP＞NIM+DDP；而對(duì)照組與NIM組的陽(yáng)性表達(dá)，（P＞0.05），無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NIM+DDP與DDP組、對(duì)照組、NIM組的陽(yáng)性表達(dá)（P＜0.001）。四組之間總體比較χ2值為42.715（見表4，圖3）。TGF-β陽(yáng)性染色定位于胞漿/胞質(zhì)染色，呈棕黃色彌漫著色。NIM+DDP組的陽(yáng)性表達(dá)最弱（見圖3）。

表4 TGF-β在各組肺癌A549移植瘤中的表達(dá)Tab.4 TGF-expression in lung cancer A549 xenografts in each group

3 討論

腫瘤新生血管形成的一系列過程是在新生血管調(diào)節(jié)因子的嚴(yán)密調(diào)控下，使得腫瘤細(xì)胞自體分泌的生長(zhǎng)因子然后作用于它自身的生長(zhǎng)受體，從而形成自分泌循環(huán)，刺激新生血管的不斷增殖，促使腫瘤細(xì)胞無休止的生長(zhǎng)與浸潤(rùn)[10]。

本研究前期實(shí)驗(yàn)表明:COX-2在肺腺癌中高表達(dá)，并可促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖[11]。另有研究表明，bFGF[12]，能直接誘導(dǎo)血管生成，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的bFGF還可以引起TGF-β1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子減弱，且三者表達(dá)時(shí)微血管密度（microvessel density，MVD）顯著增加。COX-2是前列腺素合成過程中的限速酶[13]，正常生理狀態(tài)未見其表達(dá)，在血管生長(zhǎng)因子分泌過多、癌基因刺激下，機(jī)體COX-2表達(dá)增強(qiáng)，并通過前列腺素、血栓素途徑，刺激血管生成增強(qiáng)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:尼美舒利對(duì)肺癌A549裸鼠移植瘤有抑制作用，尼美舒利與順鉑聯(lián)合對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)，推測(cè)，尼美舒利有協(xié)同順鉑起到抑制肺腫瘤的生長(zhǎng)的作用。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，COX-2在尼美舒利組與對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)有明顯差異（P＜0.05），肺癌中COX-2的表達(dá)可被選擇性COX-2抑制劑尼美舒利所抑制。我們免疫組化結(jié)果還表明，尼美舒利順鉑聯(lián)合組COX-2的表達(dá)分別與尼美舒利組、順鉑組、對(duì)照組比較，有顯著差異（P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們前期體外實(shí)驗(yàn)研究也得出相同的結(jié)果。國(guó)外研究表明:在卵巢癌研究中[14]，發(fā)現(xiàn)選擇性COX-2抑制劑可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)凋亡的敏感性，二者聯(lián)合時(shí)明顯降低卵巢癌細(xì)胞株的增殖，降低順鉑的用量。

bFGF[15]能直接誘導(dǎo)血管生成。TGF家族是一類結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)的多肽生長(zhǎng)因子，TGF-β1是其家族成員之一，它的作用是促進(jìn)VEGF以及bFGF的形成，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化[16]。

本研究免疫組化結(jié)果顯示:肺癌A549裸鼠移植瘤細(xì)胞均有b-FGF、TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)，兩個(gè)因子陽(yáng)性染色均位于胞漿，呈棕黃色彌漫著色，表明尼美舒利單獨(dú)使用對(duì)b-FGF、TGF-β1的下調(diào)作用不明顯，當(dāng)與順鉑聯(lián)合作用于肺癌A549裸鼠移植瘤時(shí)，明顯抑制b-FGF、TGF-β1的表達(dá)，且抑制效果好于尼美舒利組以及順鉑單藥組。有研究表明[17]:選擇性COX-2抑制劑通過下調(diào)膽道腫瘤細(xì)胞VEGF、b-FGF的蛋白表達(dá)起到抑制膽道腫瘤生長(zhǎng)的作用。在非小細(xì)胞肺癌及其周圍基質(zhì)細(xì)胞中，COX-2、TGF-β1蛋白表達(dá)均增加，且瘤內(nèi)微血管密度增加，選擇性COX-2抑制劑通過抑制COX-2的表達(dá)下調(diào)TGF-β1的蛋白表達(dá)，減少微血管的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)[18]。

綜上所述，選擇性COX-2抑制劑有抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，聯(lián)合化療藥物可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，即增強(qiáng)順鉑對(duì)肺癌的細(xì)胞毒作用，從而更好地發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，在肺癌的治療中有重要意義，為肺癌的綜合治療提供了新的方案。

4 結(jié)論

選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌的生長(zhǎng)有抑制作用，抑瘤率明顯高于順鉑單藥組;選擇性COX-2抑制劑增強(qiáng)順鉑對(duì)肺癌的抑瘤作用，可能通過下調(diào)肺癌新生血管因子COX-2、bFGF、TGF-β1的蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制肺癌血管新生，達(dá)到協(xié)同抗腫瘤的作用。選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合順鉑將有可能為肺癌綜合治療提供新思路。