譚周倩，錢 驊，黃曉德，韓凱樂，楊建新，趙伯濤

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211111； 2.新疆伊犁紫蘇麗人生物科技有限公司，新疆維吾爾自治區(qū) 伊寧 835000)

薰衣草(LavandualaangustifoliaMill)是唇形科薰衣草屬植物，其傳統(tǒng)利用是由薰衣草的花穗中提取精油，但目前對薰衣草莖葉研究和利用較少，未能充分體現(xiàn)薰衣草資源的價值。薰衣草莖葉生物量較大，且含有揮發(fā)油和有機(jī)酸、黃酮類[1-5]等功能成分，薰衣草中的有機(jī)酸中主要為熊果酸、齊墩果酸、綠原酸和迷迭香酸。熊果酸和齊墩果酸為五環(huán)三萜酸類化合物，互為同分異構(gòu)體，具有相同或相似的生物活性，現(xiàn)已證實(shí)熊果酸和齊墩果酸具有抗腫瘤、抗炎、護(hù)肝、抗氧化、抗病毒、降血脂、降血糖、抗菌等藥理作用[6-16]。迷迭香酸和綠原酸為酚酸類化合物，綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化和抗炎以及治療代謝類疾病等藥理作用[17]；迷迭香酸具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗過敏等藥理作用[18]。本研究在前期研究薰衣草莖葉精油含量和成分的基礎(chǔ)上[19]，進(jìn)一步對薰衣草莖葉中有機(jī)酸類成分進(jìn)行分析研究，以期為薰衣草資源利用途徑拓展和綜合利用開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薰衣草莖葉(產(chǎn)于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁地區(qū)) 由伊犁紫蘇麗人生物科技有限公司提供；熊果酸(標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、齊墩果酸(標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、綠原酸(標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、迷迭香酸(標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)， 上海阿拉丁生物科技股份有限公司；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)， TEDIA公司；乙醇(分析純)、磷酸(分析純)， 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋(XMTD203，江蘇科析儀器有限公司)；水循環(huán)式真空泵(SHZ-Ⅲ，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平 (FA2004，上海越平科學(xué)儀器有限公司)；高效液相色譜儀(Agilent1200，美國Agilent公司)高速萬能粉碎機(jī)(90G，江陰市藥化機(jī)械有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸等標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別精密稱取10 mg并用無水乙醇溶解，分別定容于10 mL容量瓶中，充分搖勻，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液，貼好標(biāo)簽并置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 色譜條件

2.2.1 熊果酸和齊墩果酸色譜條件

色譜柱：安捷倫Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(84%)-0.17%磷酸水溶液(16%)，流速1 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 綠原酸和迷迭香酸色譜條件

色譜柱：安捷倫Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(13%)-0.34%磷酸水溶液(87%)，梯度洗脫，見表1所示，流速1 mL/min,檢測波長330 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將熊果酸、齊墩果酸、綠原酸和迷迭香酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成濃度梯度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL的溶液，0. 45 μm微膜過濾，按照“2.2.1”的色譜條件進(jìn)樣。

2.4 樣品制備

將薰衣草莖葉除雜干燥，粉碎，過20目篩，得薰衣草莖葉粉末，混合均勻，天平稱取薰衣草莖葉粉末10 g，置于索氏提取器中，80%的乙醇，回流提取5h，提取液過濾，濃縮并定容，最后將其放在室溫靜置，取少量提取液，0. 45 μm微膜過濾，得到樣品溶液，備用。

2.5 精密度試驗(yàn)

將“2.4”提取得到的樣品溶液搖勻，0.45 μm微膜過濾，根據(jù)相應(yīng)有機(jī)酸的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，得樣品溶液中熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸的峰面積，并且計(jì)算出有機(jī)酸的含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值，以評價儀器的精密度。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將“2.4”提取得到的樣品溶液搖勻，0.45 μm微膜過濾，根據(jù)相應(yīng)有機(jī)酸的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，得樣品溶液中熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸的峰面積，并且計(jì)算出以上幾種有機(jī)酸的含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值，以評價樣品溶液的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取“2.4”樣品溶液3份，0.45 μm微膜過濾，根據(jù)相應(yīng)有機(jī)酸的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，得樣品溶液中熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸的峰面積，并且計(jì)算以上幾種有機(jī)酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值，以評價方法的重復(fù)性。

2.8 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取“2.4”條件下提取的已知熊果酸、齊墩果酸、綠原酸和迷迭香酸含量的樣品液各1 mL，每個樣6份，并加入以上已知含量的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，根據(jù)相應(yīng)有機(jī)酸的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，測得熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸的峰面積，計(jì)算平均加樣回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值。

2.9 含量的測定

吸取少量“2.4”的樣品溶液，0.45 μm微膜過濾，根據(jù)相應(yīng)有機(jī)酸的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣。得到各個有機(jī)酸的峰面積，將其代入相應(yīng)有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線中進(jìn)行計(jì)算，并按照式(1)計(jì)算薰衣草莖葉中有機(jī)酸的含量：

(1)

式中：C——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總提取液中有機(jī)酸的濃度(mg/mL)；

V——樣品溶液的體積(mL)；

M——薰衣草莖葉質(zhì)量(g)

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過數(shù)據(jù)歸納和分析，峰面積與其質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，得到熊果酸和齊墩果酸良好的線性回歸方程，如圖1所示，熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=6 553.4x+41.58，R2=0.999 1；齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1 0661x-16.446，R2=0.999 4。經(jīng)過數(shù)據(jù)的歸納和分析，峰面積與其質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，得到綠原酸和迷迭香酸良好的線性回歸方程。如圖2，綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=26 473x-74.194，R2=0.999 4；迷迭香酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=38 408x-44.289，R2=0.999 5。通過該結(jié)果，由此可知，當(dāng)上述有機(jī)酸的進(jìn)樣濃度控制在0.05～0.8 mg/mL的范圍時，其呈現(xiàn)的線性關(guān)系良好。

3.2 精密度結(jié)果

如表 2所示，測得熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.20%、1.59%、0.49%、0.34%，表明儀器精密度良好。

圖1 熊果酸和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of ursolic acid and oleanolic acid

圖2 綠原酸和迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of chlorogenic acid and rosmarinic acid

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 穩(wěn)定性結(jié)果

如表3所示，測得熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.72%、1.90%、1.46%、1.69%，表明樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性結(jié)果

如表4所示，測得熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.48%、0.28%、0.54%、0.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.5 回收率結(jié)果

如表5所示，熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸的平均加樣回收率分別為100.51%、99.70%、101.26%、99.11%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.09%、1.85%、1.64%、0.84%，該結(jié)果表明試驗(yàn)結(jié)果可靠。

表3 供試品溶液穩(wěn)定性測定結(jié)果Table 3 Test results of test solution stability

表4 重現(xiàn)性測定結(jié)果Table 4 Results of reproducibility experiment

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Test results of sample adding and recovery

3.6 含量測定結(jié)果

薰衣草莖葉中熊果酸、齊墩果酸、綠原酸和迷迭香酸含量測定結(jié)果如表6所示，熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸的含量分別為1.78%、0.34%、0.31%、0.48%。薰衣草莖葉中這幾種有機(jī)酸含量順序：熊果酸>迷迭香酸>齊墩果酸>綠原酸。

表6 有機(jī)酸含量Table 6 Comparison of organic acid content

4 討論與結(jié)論

本研究利用HPLC法建立了同時測定熊果酸，齊墩果酸，綠原酸和迷迭香酸方法。通過精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收試驗(yàn)，確定儀器精密度良好、樣品溶液穩(wěn)定、方法可靠，為薰衣草莖葉中有機(jī)酸含量的測定確定了可行的方法。

本研究利用HPLC法對薰衣草莖葉中的綠原酸、迷迭香酸、熊果酸和齊墩果酸含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明薰衣草莖葉中熊果酸含量較高，達(dá)到了1.79%，比現(xiàn)有提取熊果酸的植物原料中含量均高，而且薰衣草莖葉中迷迭香酸、齊墩果酸、綠原酸含量也比較高，分別為：0.48%、0.34%、0.31%。

熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、迷迭香酸等有機(jī)酸因具有廣泛的生物活性而備受關(guān)注。作為天然成分，上述幾種有機(jī)酸廣泛存在于各種植物中，但在各種植物中含量差異大，如相延英[20]等測定了常用中藥中熊果酸和齊墩果酸含量，在所測的的11種藥材中熊果酸含量在0.0137%～1.0065%之間，齊墩果酸含量在0.0203%～0.8028%；鄒盛勤[21]等研究30種江西產(chǎn)植物中熊果酸的含量在0.106%～0.583%之間，目前制備天然熊果酸主要從枇杷葉和白花蛇舌草提取為主，齊墩果酸從女貞子中提取，綠原酸主要從金銀花、綠咖啡等原料中提取得到，迷迭香酸主要從迷迭香葉中提取。因此，薰衣草莖葉完全可以作為熊果酸等有機(jī)酸提取物的原料進(jìn)行開發(fā)利用，進(jìn)一步研究薰衣草有機(jī)酸提取物作為植物生物刺激素、動物飼料添加劑[22]利用的可行性將拓寬薰衣草資源的利用途徑，將有效提高薰衣草產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)新疆薰衣草產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。