王紅梅，陳玉梁，馬彥軍，劉新星，石有太，王立光，楊 釗

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 黃羊試驗場，甘肅 武威733006；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)屬茄科(Solanaceae)枸杞屬(LyciumL.)多年生落葉灌木，具有很強(qiáng)的耐旱、耐鹽堿性，為我國西北荒漠地區(qū)特有的野生植物資源，主要分布于青海、甘肅、新疆和寧夏等省區(qū)[1-2]。黑果枸杞作為一種藥食同源植物，其成熟果實中包括氨基酸、維生素、微量元素、多糖、總黃酮等營養(yǎng)成分，醫(yī)藥活性物質(zhì)種類多，含量豐富，具有抗腫瘤、軟化血管、防衰老及增強(qiáng)免疫力等保健和藥用價值[3-5]；其干果中花色苷的含量高達(dá)369 0 mg/100 g，穩(wěn)定性好, 著色力強(qiáng)，是理想的食用天然花色苷[6-7]。黑果枸杞抗寒、抗旱、耐鹽堿，根蘗性強(qiáng)，以群落形式分布于干旱鹽堿地、荒漠、戈壁與半荒漠地區(qū)，是防風(fēng)固沙、荒漠化土壤改良的優(yōu)良植物資源，具有極高的生態(tài)學(xué)價值[8]。

枸杞為常異花授粉植物，多數(shù)自交不親和，基因型高度雜合，種子繁育后代容易發(fā)生性狀分離，通過營養(yǎng)繁殖方式選育出的無性系在形態(tài)上極為接近[9]。黑果枸杞分布地域廣、繁殖方式多樣，野生種經(jīng)過人工栽培馴化以及自然遺傳變異過程，形成了許多栽培品種及類型。但目前由于枸杞基因組基礎(chǔ)研究薄弱，遺傳信息缺乏，品種間遺傳背景不清楚，親緣關(guān)系模糊、分類不明確，優(yōu)良種質(zhì)的特性難以通過品種間的自然雜交被利用[10]。近年來，隨著市場需求量的持續(xù)上升，黑果枸杞人工栽培和推廣速度加快，不同地區(qū)之間品種資源交流愈加頻繁，造成同物異名和同名異物現(xiàn)象非常普遍，使得枸杞品種鑒定困難[11]。因此，開展黑果枸杞種質(zhì)資源親緣關(guān)系及遺傳多樣性的研究，對黑果枸杞種質(zhì)資源分類、鑒定評價和利用具有重要意義。

簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)分子標(biāo)記是以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，一般由1～6個核苷酸為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR標(biāo)記在基因組間廣泛分布，具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、檢測手段簡便易行等優(yōu)點，目前被廣泛應(yīng)用于植物的品種鑒定、基因定位、遺傳作圖、分類與進(jìn)化等諸多領(lǐng)域。SSR標(biāo)記豐富的多態(tài)性信息，能準(zhǔn)確高效地鑒別出大量的等位基因，因而適合品種的鑒定，特別是親緣關(guān)系非常近而用其它方法無法區(qū)分的品種[12]。本研究以甘肅、青海、寧夏、新疆等地采集到的黑果枸杞種質(zhì)為材料，初步建立了黑果枸杞SSR分子標(biāo)記指紋圖譜，從分子水平上揭示不同來源黑果枸杞遺傳差異和親緣關(guān)系，以期為黑果枸杞資源鑒定和有效利用研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究材料分別采集于甘肅、青海、寧夏、新疆等西北荒漠地區(qū)(表1)，共22份，其中黑果枸杞19份均為野生資源，紅果枸杞2份為栽培資源(對照材料)，黃果枸杞1份為栽培資源(對照材料)，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所石有太助理研究員與甘肅省農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院馬彥軍副教授聯(lián)合采集、鑒定并定植于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院和黃羊試驗場種質(zhì)資源圃。

表1 枸杞種質(zhì)來源和生境Tabel 1 Habitats and localities of the sampled L. ruthenicum

1.2 試驗方法

1.2.1 枸杞DNA的提取

采集枸杞新鮮葉片0.2 g，在液氮中磨成粉末，采用試劑盒(TIANGEN DP320)提取樣本基因組DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，紫外分光光度計測定DNA濃度和純度，最后用dd H2O將每個樣品的DNA稀釋至50 ng/L，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物

61對SSR引物序列信息來源于公開發(fā)表的枸杞及其近緣屬植物的SSR標(biāo)記[12-15]。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果統(tǒng)計條帶，按在凝膠相同遷移位置上有無條帶進(jìn)行記錄，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”構(gòu)成“0，1”矩陣。采用POPGENE 1.32軟件計算SSR標(biāo)記檢測到的等位基因數(shù)(Number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)位點百分率(Percentage of polymorphic bands, PPB)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)；利用NTSYS-pc 2.10軟件計算供試材料的遺傳相似系數(shù)(GS)，并進(jìn)行UPGMA聚類分析，通過Tree plot模塊繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選及多態(tài)性分析

選取遺傳背景和表型性狀差異較大的敦煌孟家橋黑果枸杞和寧杞1號紅果枸杞，分別以61對SSR引物對其基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，從中篩選出多態(tài)性高、電泳譜帶清晰且重復(fù)性好的引物37對(表2)，用于22份供試材料的遺傳多樣性分析。37對引物在22枸杞材料中共檢測到233個基因位點，其中多態(tài)性位點213個，多態(tài)性位點百分率為91.4%；擴(kuò)增片段長度在100～400 bp之間(圖1)；單引物對可擴(kuò)增出2～14條譜帶，平均為6.3條。SM0138、SF80、SF74、SF53等24對引物檢測到的等位變異，其多態(tài)性位點為100%，可用于枸杞資源材料的種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性研究。用POPGENE1.32軟件對試驗數(shù)據(jù)分析計算，22個枸杞材料平均等位基因數(shù)Na為1.898 3，有效等位基因數(shù)Ne為1.331 4，遺傳多樣性指數(shù)H為0.210 6，Shannon信息指數(shù)I為0.338 4，說明供試材料遺傳多樣性較為豐富，且SSR標(biāo)記能有效的揭示枸杞種質(zhì)材料的多態(tài)性。

表2 SSR引物序列和擴(kuò)增情況Tabel 2 Primers sequences and amplified results

續(xù)表2 SSR引物序列和擴(kuò)增情況Tabel 2 Primers sequences and amplified results

圖1 引物對CAN130829、TOM180、SSR22對22份枸杞材料的PCR擴(kuò)增結(jié)果Marker: 600, 500, 400, 300, 200, 100 bp，箭頭所指為多態(tài)性位點。Fig.1 The results of PCR amplification of L. ruthenicum from 22 materials by primers CAN130829, TOM180 and SSR22, Marker: 600, 500, 400, 300, 200, 100bp, the arrow points to polymorphic sites.

2.2 遺傳相似性分析

以22份枸杞材料和233個位點的條帶數(shù)據(jù)為原始矩陣，利用NTSYS-pc2.10 軟件計算供試材料之間的遺傳相似系數(shù)(GS)。結(jié)果表明，任意2份材料間的GS數(shù)值在0.483 1～0.936 4之間，平均GS為0.628 6(表3)。其中來自大武口十分溝的黑果枸杞和來自阿克塞多巴溝的黑果枸杞遺傳相似系數(shù)最大，為0.936 4，說明二者親緣關(guān)系最近；其次寧杞1號和寧杞2號之間遺傳相似系數(shù)為0.889 8，說明這2個紅果枸杞的遺傳背景相近；除過精河托里黃果枸杞和基布克村黑果枸杞之外，紅果枸杞寧杞1號、寧杞2號和其他黑果枸杞之間的遺傳相似系數(shù)均低于平均值，以寧杞1號與德令哈蓮湖的枸杞之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.483 1，表明寧夏紅果枸杞與青海德令哈蓮湖黑果枸杞之間存在較大的遺傳差異，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。22份材料GS數(shù)值在0.483 1～0.936 4之間，跨度較大表明供試材料之間遺傳多樣性較為豐富。

基于SSR的擴(kuò)增結(jié)果，采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，得到22份供試材料的親緣關(guān)系樹狀圖(圖2)。在遺傳相似系數(shù)0.61處，所有供試材料分為2個類群，Ⅰ類和Ⅱ類，2個寧夏紅果枸杞與青海格爾木和新疆基布克村的黑果枸杞聚為Ⅰ類，其中寧杞1號和寧杞2號的相似性系數(shù)為0.889 8，遺傳背景較近；相似系數(shù)為0.779 7時，來自新疆精河縣的黃果枸杞和不同地區(qū)的17份黑果枸杞材料聚為Ⅱ類，精河的黃果枸杞獨立聚類，17份黑果枸杞材料全部聚為一類；至此，紅果枸杞、黃果枸杞與黑果枸杞之間可完全分類。來自甘肅、青海、寧夏和新疆的17份黑果枸杞材料，在相似系數(shù)0.800 8處聚為2個亞類，來自寧夏興慶、惠農(nóng)和中衛(wèi)的黑果枸杞獨立聚為1個亞類，其余14個材料另外聚為1個亞類，寧夏和甘肅地理來源相近的部分材料聚為一類，新疆的種質(zhì)材料在聚類圖中分布相對分散。聚類結(jié)果表明，SSR標(biāo)記適用于枸杞屬植物種質(zhì)遺傳多樣性分析及遺傳關(guān)系研究；不同種類枸杞對系統(tǒng)聚類結(jié)果影響較大，地理來源不同的材料在聚類圖中既有區(qū)別又有交叉，地域分布規(guī)律性不明顯。

3 討論

種質(zhì)資源是遺傳育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，遺傳多樣性水平的高低代表了該物種在特定環(huán)境中基因的豐富程度。對種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行研究是種質(zhì)資源有效利用和優(yōu)良新品種培育的重要環(huán)節(jié)[16]。目前，我國在枸杞種質(zhì)資源生產(chǎn)和經(jīng)營方面還很不規(guī)范，尤其是黑果枸杞大多處于野生狀態(tài)，沒有栽培品種或者優(yōu)良品系，引種和栽培異?；靵y，多數(shù)“品種”(系)在形態(tài)上相似性極高或同一“品種”(系)在不同地區(qū)皆有栽培，給枸杞種質(zhì)鑒定帶來一定困難[17]。DNA分子標(biāo)記是在分子水平上直接對DNA進(jìn)行研究，能克服林木世代周期長、遺傳基因高度復(fù)雜等問題，是進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、品種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等研究的有效工具，更是客觀、高效及準(zhǔn)確的種質(zhì)鑒定技術(shù)[18]。

本研究采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對來自甘肅、青海、寧夏、新疆不同省區(qū)的22個枸杞材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出37對SSR引物共檢測到233個等位變異，其中多態(tài)性位點213個，平均每個引物擴(kuò)增條帶數(shù)為6.3條，多態(tài)性位點比率為91.4%，遺傳相似系數(shù)在0.483 1～0.936 4之間，平均GS值為0.628 6，在分子水平上證明了不同省區(qū)供試黑果枸杞之間差異較大，遺傳多樣性較為豐富。通過遺傳距離測算明確了供試材料間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，以大武口十分溝和阿克塞多巴溝的黑果枸杞遺傳相似系數(shù)最大(0.936 4)，可能是由于地區(qū)之間相互引種引起枸杞遺傳背景相似；而表型性狀非常相似的寧杞1號和寧杞2號借助分子標(biāo)記可以有效區(qū)分開來，充分證明了SSR標(biāo)記技術(shù)可以從分子水平上有效鑒別枸杞種質(zhì)間的遺傳差異。本研究篩選出的37對SSR引物，將為枸杞品種鑒定和今后枸杞遺傳育種研究提供技術(shù)支撐。

圖2 22個枸杞樣本的UPGMA聚類分析圖Fig.2 The UPGMA dendrogram of 22 samples based on SSR markers

根據(jù)聚類分析來判斷枸杞種質(zhì)材料之間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近比較準(zhǔn)確。聚類分析發(fā)現(xiàn)，在相似系數(shù)0.61處所有供試材料分為2個類群，Ⅰ類和Ⅱ類，2個寧夏紅果枸杞與青海格爾木和新疆基布克村的黑果枸杞聚為Ⅰ類，其中寧杞1號和寧杞2號的遺傳背景較近，相似性系數(shù)達(dá)0.889 8；在相似系數(shù)為0.779 7水平，精河的黃果枸杞獨立聚類，17份黑果枸杞材料全部聚為一類，試驗結(jié)果可將紅果枸杞、黃果枸杞與黑果枸杞之間可完全分類。來自甘肅、青海、寧夏和新疆的17份黑果枸杞材料，在相似系數(shù)0.800 8處聚為2個亞類，寧夏興慶、惠農(nóng)和中衛(wèi)的黑果枸杞獨立聚為1個亞類，其余14個材料另外聚為1個亞類。本研究中供試材料的聚類分析結(jié)果與供試材料的種類有較好的一致性，同一地理來源材料在不同程度上聚為一類(如來自于寧夏、甘肅的部分材料)，不同來源地黑果枸杞材料在聚類圖中既有區(qū)別又有交叉，尤其新疆的材料在幾個亞類中分布相對分散。分析認(rèn)為風(fēng)媒和鳥類攜帶不同地域枸杞的花粉和種子交叉?zhèn)鞑?，可能?dǎo)致部分地理來源不同的材料遺傳背景相似；同時西北荒漠區(qū)氣候環(huán)境的復(fù)雜性影響枸杞的自然選擇方向，導(dǎo)致地理來源相近的材料遺傳變異較大，因此出現(xiàn)了地理來源相近的材料被歸入不同類群。