王宏，范海霞，Tai-Hsien Wu，Ching-chang Ko，耿海霞

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 口腔醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧272000；3.俄亥俄州立大學(xué)牙科學(xué)院 正畸學(xué)部，俄亥俄州 哥倫布 43210）

骨組織工程為骨缺損修復(fù)提供了新的方向。由于材料的不斷改進(jìn)，學(xué)者們對于骨替代材料的研究與構(gòu)建，已從單一類型的支架材料逐漸過渡至復(fù)合型支架材料[1-2]。其中羥基磷灰石（Hydroxyapatite, HAP）和明膠（Gelatin, GEL）構(gòu)成的復(fù)合型支架材料在組織工程學(xué)研究中具有很大優(yōu)勢，目前已成為骨組織再生領(lǐng)域中的研究熱點[3]。研究表明，這種支架成分與天然骨組織中磷灰石礦物組成極為相似，具有仿生特性，且支架的機(jī)械、生物學(xué)性能好、骨傳導(dǎo)性和骨結(jié)合能力強(qiáng)，在骨修復(fù)方面具有明顯的優(yōu)勢[4-5]。近年來，隨著3D 打印技術(shù)的發(fā)展，精確打印的三維多孔支架在骨組織工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，成為頜面部骨缺損治療的熱點和新突破點[6-7]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）是骨組織工程常用的種子細(xì)胞，有研究顯示，將BMSCs 和HUVECs 種子細(xì)胞共培養(yǎng)，其成骨和成血管潛能較單獨培養(yǎng)時提高[8]，可能為骨組織工程和骨再生提供一個很有前景的方法。

本實驗根據(jù)前期實驗[9]，制備出3D 打印HAPGEL 支架，負(fù)載BMSCs 和HUVECs 種子細(xì)胞后用于兔顱骨缺損修復(fù)，通過組織學(xué)觀察其在臨界大小骨缺損中的成骨修復(fù)效果，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物選用健康普通級、8 周齡、雄性新西蘭大白兔24 只，動物許可證號：SCXK（魯）20150001，體重1.5 ～2.0 kg，由濟(jì)南西嶺養(yǎng)殖繁育中心提供。

1.1.2 種子細(xì)胞BMSCs 和HUVECs 細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.3 HAP-GEL 支架材料HAP-GEL 支架由納米級羥基磷灰石和明膠經(jīng)3D 打印制備而成，直徑8 mm，厚度2 mm，呈圓形片狀，由美國北卡羅萊納大學(xué)牙學(xué)院研究中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司），水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），慶大霉素（濟(jì)寧辰欣藥業(yè)股份有限公司），石蠟切片機(jī)（型號RM2235，德國萊卡公司），烘箱（型號Heratherm OMS60，美國Thermo Fisher Scientific 公司），蘇木精-伊紅染色試劑盒（北京索萊寶生物有限公司），Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），正置顯微鏡（型號E200，日本Nikon 公司）。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合體構(gòu)建將EO 滅菌后的HAP-GEL 支架材料浸沒于DMEM 培養(yǎng)基，并于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5%二氧化碳）內(nèi)孵育24 h。共培養(yǎng)BMSCs 和HUVECs細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，HAP-GEL 支架浸泡于細(xì)胞懸液中，負(fù)壓抽吸，靜置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中3 d，使種子細(xì)胞充分黏附。

1.3.2 動物模型的復(fù)制及分組新西蘭大白兔稱重后，用10%水合氯醛按3 ml/kg 行腹腔注射麻醉，待麻醉完畢后，將其俯臥位妥善固定于手術(shù)臺，頭部備皮，縱行切開顱頂部皮膚，仔細(xì)剝離骨膜，暴露顱骨。用環(huán)切刀在顱骨矢狀縫左側(cè)，慢速全層切除直徑為0.8 cm 的圓形骨缺損，術(shù)中輔以滴水降溫。將24 只新西蘭大白兔編號后，隨機(jī)分為空白對照組、陽性對照組、HAP-GEL 材料組及BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培養(yǎng)組，每組6 只。空白對照組留置空白缺損；陽性對照組在骨缺損處隨機(jī)植入自體顱骨；HAP-GEL 材料組在骨缺損處隨機(jī)植入HAP-GEL 支架；BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培養(yǎng)組在骨缺損處隨機(jī)植入HAP-GEL 支架與BMSCs 和HUVECs細(xì)胞復(fù)合體。術(shù)區(qū)組織分層對位縫合，術(shù)后肌內(nèi)注射慶大霉素4 萬u/d，1 次/d，共3 d。

1.3.3 組織學(xué)觀察分別于術(shù)后4 周和12 周處死新西蘭大白兔，于組織工程骨成骨區(qū)外3 mm 取材，4%多聚甲醛固定48 h，10% EDTA 溶液常溫下脫鈣處理，脫鈣液更換頻率為1 次/3 d，期間用大頭針輕戳標(biāo)本，至針頭可輕松刺入標(biāo)本提示脫鈣完成。標(biāo)本流水沖洗過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，制成厚度為4μm 的組織切片，行HE 染色及Masson 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組材料與組織相容性、新生骨組織和骨質(zhì)成熟情況。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后7 d 切口達(dá)到一期愈合。術(shù)后新西蘭大白兔無死亡，術(shù)區(qū)無感染，飲食、活動正常。

2.2 HE 染色

各組均未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。術(shù)后4 周，空白對照組骨缺損區(qū)內(nèi)僅有少量纖維結(jié)締組織生成，呈網(wǎng)格狀，稀疏排列（見圖1A）；HAP-GEL 材料組有少量新骨生成，呈島狀散在分布于纖維結(jié)締組織及不規(guī)則骨小梁中（見圖1B）；BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培養(yǎng)組可見部分新骨開始彼此融合（見圖1C），新生骨量與陽性對照組相似（見圖1D）。術(shù)后12 周，空白對照組可見缺損區(qū)內(nèi)僅有小面積骨島形成（見圖2A）；HAP-GEL 材料組新骨相互融合，呈較大面積的板層狀（見圖2B）；BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培養(yǎng)組新生骨量較前兩組明顯增多，缺損區(qū)幾乎全部被新骨充填（見圖2C）；陽性對照組新骨形成量與BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培養(yǎng)組相似（見圖2D）。

圖1 術(shù)后4 周各組骨缺損處的組織學(xué)觀察 （HE 染色×100）

圖2 術(shù)后12 周各組骨缺損處的組織學(xué)觀察 （HE 染色×100）

2.3 Masson 染色

術(shù)后4 周，空白對照組僅存在少量纖維組織充填于骨缺損區(qū)（見圖3A）；HAP-GEL 材料組內(nèi)有藍(lán)染的新生骨形成，并已出現(xiàn)少量夾雜藍(lán)染新骨的紅染成熟骨，但著色均較淺（見圖3B）；BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培養(yǎng)組可見深染藍(lán)色新骨包繞支架，且紅染成熟骨面積較HAP-GEL 材料組大（見圖3C），修復(fù)效果與陽性對照組相似（見圖3D）。術(shù)后12 周，空白對照組內(nèi)有藍(lán)染新生骨組織生成（見圖4A）；HAP-GEL 材料組成熟骨面積進(jìn)一步擴(kuò)大，支架被分割包裹、吸收（見圖4B）；BMSCs+HUVECs+HAPGEL 支架共培養(yǎng)組可見大片紅染成熟骨，其間夾雜少量藍(lán)染新生骨，支架僅殘存少量（見圖4C），成骨效果與陽性對照組相似（見圖4D）。

圖3 術(shù)后4 周各組骨缺損處的組織學(xué)觀察 （Masson 染色×100）

圖4 術(shù)后12 周各組骨缺損處的組織學(xué)觀察 （Masson 染色×100）

3 討論

種子細(xì)胞是骨組織工程骨研究的基礎(chǔ)。其中BMSCs 因來源豐富、具有較強(qiáng)的體外增殖能力和成骨分化潛能，已成為公認(rèn)的較為理想的種子細(xì)胞[10-12]。而HUVECs 也因可產(chǎn)生多種因子，以及不涉及安全性和倫理學(xué)等問題，成為組織工程學(xué)研究中應(yīng)用較為廣泛的種子細(xì)胞之一。研究證實，將上述2 種細(xì)胞共培養(yǎng)，具有相互協(xié)同的作用。加入HUVECs 后，可促進(jìn)BMSCs中I 型膠原和堿性磷酸酶的表達(dá)上調(diào)；HUVECs 也可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Dlx5、Cbfa1/Runx2、Osterix 的表達(dá)，增強(qiáng)BMSCs 的成骨能力，從而構(gòu)建有利于骨生長及骨重建的局部微生態(tài)環(huán)境[13-16]。在本實驗中，筆者通過Masson 染色證實，BMSCs+HUVECs+HAP-GEL 支架共培養(yǎng)組可見明顯的藍(lán)染新骨在支架材料周圍聚集形成，術(shù)后12 周，還可見大量的成熟骨連接成片，成骨效果和陽性對照組接近。HE 染色結(jié)果也驗證了上述發(fā)現(xiàn)。上述結(jié)果表明，HUVECs 和BMSCs 可能通過分泌某些細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子，加速骨缺損的修復(fù)過程。

支架材料是組織工程骨的重要組成部分，理想的支架材料應(yīng)具備與天然骨組織相似的性能，以模擬其修復(fù)效果[17]。HAP 是一種天然的磷灰石礦物，參與構(gòu)成骨組織中50%～70%的礦物質(zhì)成分[18]，其憑借自身優(yōu)越的生物相容性、骨誘導(dǎo)性及低免疫原性，成為目前應(yīng)用最多的生物材料[19]。普通HAP 粒徑較大，生物降解性較差，韌性不佳；但納米級HAP 具有更好的表面效應(yīng)，生物活性與降解性亦優(yōu)于普通HAP[20-21]。GEL 具有良好的生物學(xué)性能，易于降解，且結(jié)構(gòu)中含大量親水基團(tuán)，可支持種子細(xì)胞的種植；此外GEL含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽序列，能夠增加細(xì)胞的識別位點，促進(jìn)種子細(xì)胞在支架上黏附、生長[22-24]。但GEL 力學(xué)性能較差，嚴(yán)重影響了其在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用[25]。研究表明，納米級HAP 與GEL復(fù)合支架，能夠模擬天然骨的成分與微結(jié)構(gòu)特征，具有與周圍骨組織鍵合的能力[26-27]；同時GEL 可提高支架的降解速率；HAP 能夠改善支架的機(jī)械和生物性能，實現(xiàn)兩者優(yōu)勢互補(bǔ)[28]。本課題組前期研究制備合成HAP-GEL 支架，復(fù)合成骨細(xì)胞后用于兔顱骨缺損的修復(fù)，發(fā)現(xiàn)其具有一定誘導(dǎo)骨生成的作用[9]。而本實驗中采用的3D 打印HAP-GEL 支架具有以下優(yōu)勢：①支架采用3D 打印，能夠更好地與骨缺損區(qū)匹配；②術(shù)后切口處愈合良好，無明顯排異反應(yīng)；組織學(xué)觀察也未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，說明3D 打印HAPGEL 支架具有良好的生物相容性；③支架結(jié)構(gòu)為種子細(xì)胞BMSCs 和HUVECs 的黏附、生長及相互作用提供了一種生理性的優(yōu)化環(huán)境。HE 和Masson 染色結(jié)果證實，與空白對照組相比，HAP-GEL 材料組，可明顯促進(jìn)新生骨的形成，而BMSCs+HUVECs+HAP-GEL支架共培養(yǎng)組成骨效果與自體移植骨類似。這表明，3D 打印HAP-GEL 支架材料具有良好的成骨效果。

綜上所述，本實驗所采用的3D 打印HAP-GEL支架材料具有良好的骨誘導(dǎo)作用，且在種子細(xì)胞BMSCs 和HUVECs 的作用下，可更好地修復(fù)顱骨缺損，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。本實驗僅對3D 打印HAP-GEL 支架材料復(fù)合種子細(xì)胞對顱骨的修復(fù)效果進(jìn)行了組織學(xué)層面的分析，其具體的修復(fù)機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。