胡 婷,王 萍

根管治療是針對牙髓根尖周病目前的最佳療法。而針對難治性根尖周炎，根管治療也有失敗的可能。糞腸球菌是根管治療失敗的病例中檢出的常見細(xì)菌之一，與難治性根尖周炎密切相關(guān)[1,2]。糞腸球菌在饑餓期有較強(qiáng)生存力，其在牙本質(zhì)小管中形成生物膜，對根管內(nèi)的清理造成難度，釋放的各種毒力因子有較強(qiáng)的致病性，對難治性根尖周炎的治療帶來困難[3-5]。因此,針對糞腸球菌致病性相關(guān)毒力因子的研究很有必要。本實(shí)驗(yàn)通過建立饑餓期糞腸球菌生物膜模型,觀察新型三重抗生素(奧硝唑、米諾環(huán)素和環(huán)丙沙星)單獨(dú)及聯(lián)合氫氧化鈣對其毒力因子如明膠酶(gelatinase，gelE),溶細(xì)胞素(cytolysin，cyl),腸球菌表面蛋白(Enterococcus surface adhesions，esp)表達(dá)的影響，為臨床上提高難治性根尖周炎治療的成功率提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 米諾環(huán)素(江蘇惠氏制藥有限公司)，奧硝唑(華東醫(yī)藥博華制藥有限責(zé)任公司)，環(huán)丙沙星(江蘇潤邦藥業(yè)有限公司)，氫氧化鈣(上海第二醫(yī)科大學(xué)張江生物制品公司)，BHI/BHIA培養(yǎng)液(青島海博生物技術(shù)有限公司)，糞腸球菌ATCC29212(廣東省環(huán)凱微生物科技有限公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, Japan)，RNAiso Plus (TaKaRa, Japan) GoTaq? qPCR Master Mix (Promega, USA)。

1.2 方法

1.2.1 饑餓期糞腸球菌生物膜的建立 用BHI液體培養(yǎng)液溶解糞腸球菌凍干菌粉，進(jìn)行細(xì)菌復(fù)蘇。對細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色后顯微鏡下觀察并鑒定。挑取復(fù)蘇的糞腸球菌置于BHI液體培養(yǎng)液中37 ℃、5%CO2、95%N2培養(yǎng)48 h，進(jìn)入饑餓期，取此菌液，5000 r/min離心10 min，并用PBS緩沖液重復(fù)離心2次后，用無菌PBS緩沖液將細(xì)菌濃度調(diào)整到0.5 Mc(1.5 × 108 CFU/ml)標(biāo)準(zhǔn)。將配置好的菌液接種到無菌24孔板中，在20 min內(nèi)完成操作。然后將24孔板置于37 ℃、5%CO2、95%N2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h，24 h時更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后在板底部肉眼可以看到有灰白色膜狀物形成。

1.2.2 分組封藥 用無菌PBS緩沖液輕輕沖洗24孔板數(shù)次，以去除表面及周圍浮游狀態(tài)的細(xì)菌，隨后將根管消毒藥物三重抗生素糊劑(奧硝唑、米諾環(huán)素和環(huán)丙沙星等比例混合，加入無菌生理鹽水配成濃度為1000 mg/ml糊劑[6]，TAP組)、氫氧化鈣(與無菌生理鹽水等比例調(diào)成糊劑，pH=10，CH組)、三重抗生素聯(lián)合氫氧化鈣(三重抗生素和氫氧化鈣等比例混合，TAP+CH組)分別作用于糞腸球菌生物膜，對照組放入等量生理鹽水。作用于糞腸球菌生物膜24 h后，加入0.6%硫代硫酸鈉溶液終止藥物的作用。生物膜樣本通過在板底刮取和大力吹打取得。

1.2.3 細(xì)菌RNA的提取 將上述剛?cè)〉玫臉颖境浞终鹗帲≈罞P管中，按 RNAiso Plus Total RNA提取試劑說明來提取細(xì)菌總RNA。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用上面步驟提取的RNA作為模板，使用 Eppendorf PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)驗(yàn)步驟按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Mohamed等[7]研究報道，如表1。引物設(shè)計(jì)完成后委托南京金斯瑞公司合成。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR 采用GoTaq? qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，按照使用說明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。本實(shí)驗(yàn)選擇20 μl反應(yīng)體系:GoTaq? qPCR Master Mix(10 μl)，模板cDNA(2 μl)，PCR Forward Primer(0.4 μl)，PCR Reverse Primer(0.4 μl)，Nuclease-free Water(7.2 μl)?；靹蚩焖匐x心一次。PCR反應(yīng)參數(shù)如下：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。每例樣品均設(shè)3個平行復(fù)孔。

計(jì)算方法：根據(jù)熒光信號，收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，測定各樣品的Ct值。采用比較閾值法測定基因的相對表達(dá)量。其表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析采用國際通用的相對定量法(2-ΔΔCT法)。計(jì)算公式：△△Ct=[Ct(目的)-Ct(內(nèi)參)]待測樣品-[Ct(目的)-Ct(內(nèi)參)]校正樣品。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

2 結(jié) 果

TAP+CH組、TAP組、CH組和對照組，gelE、cylA和esp的表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TAP+CH組和TAP組的gelE、cylA和esp的表達(dá)量小于CH組(P<0.05)，CH組的gelE、cylA和esp的表達(dá)量均小于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TAP+CH組和TAP組作用的gelE、cylA和esp的表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表2)。

表2 不同藥物作用后糞腸球菌生物膜毒力基因的表達(dá)情況

3 討 論

牙髓根尖周病在牙髓感染炎性反應(yīng)的不斷發(fā)生發(fā)展下，進(jìn)一步造成根尖及牙槽骨的破壞吸收，是導(dǎo)致失牙的主要原因之一。而感染的控制是根管治療成功的關(guān)鍵。目前在根管治療失敗病例中殘留的感染細(xì)菌主要有糞腸球菌、牙齦卟啉單胞菌、微小消化鏈球菌、中間普氏菌、產(chǎn)黑素桿菌和衣氏放線菌等[1,8,9]。其中糞腸球菌在失敗病例中呈高檢出率，Rocas等[10]在根管治療失敗病例中對糞腸球菌的檢出率高達(dá)77%。

糞腸球菌普遍存在于自然界，一般較常見于各種動物的腸道，也是人體上呼吸道，腸道的常居菌。糞腸球菌的感染可引起腦膜炎、心內(nèi)膜炎、膽囊炎、尿路感染及傷口感染等多種全身疾病。它是兼性厭氧革蘭陽性細(xì)菌，同時與根管治療失敗密切相關(guān)。有研究表明糞腸球菌在根管內(nèi)頑固殘留可能與其營養(yǎng)需求低、能獨(dú)自存活、耐受高pH值和極易侵入牙本質(zhì)小管有關(guān)[11-13]。

糞腸球菌形成生物膜的能力使其具有浮游狀態(tài)下所沒有的生存優(yōu)勢,包括抵抗宿主防御機(jī)制、耐受抗生素、對抗惡劣低營養(yǎng)環(huán)境和毒力的增強(qiáng)[14]。其釋放的毒力因子如gelE、cyl、esp、絲氨酸蛋白酶(serine proteinase)和黏附素(adhesin)等對其致病機(jī)制、宿主免疫應(yīng)答和生物膜的形成有著重要的關(guān)系[3,4,12]。因此，對糞腸球菌毒力因子作用的深入研究對難治性根尖周炎的防治有著重要的作用。

目前，與糞腸球菌生物膜形成相關(guān)的毒力因子主要有esp、gelE、cylA和聚集物質(zhì)(AS)等。esp是糞腸球菌分子量最大的表面蛋白質(zhì)，研究認(rèn)為其與糞腸球菌生物膜的形成顯著相關(guān)，它能促進(jìn)糞腸球菌在生物膜中細(xì)菌之間的黏附并且能促使細(xì)菌對非生物組織表面的附著[12]。gelE是一種含鋅的胞外基質(zhì)金屬蛋白酶，它能夠水解明膠、酪蛋白、膠原、血紅蛋白和其他生物活性物質(zhì)來獲得存活所需要的肽營養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)gelE與生物膜的形成密切相關(guān)，Mohamed等[15]發(fā)現(xiàn)，在敲除gelE基因的情況下，糞腸球菌生物膜形成能力下降[7]。cylA是糞腸球菌感染最重要的致病物質(zhì)之一，它同時具有殺細(xì)胞和溶血活性。由于根管治療失敗的病例中糞腸球菌大多處于饑餓期，故本實(shí)驗(yàn)選用饑餓期糞腸球菌生物膜進(jìn)行研究。

基于糞腸球菌在難治性根尖周炎中不可忽視的影響，目前對其抗菌藥物的研究越來越多，尋找有效針對糞腸球菌的根管消毒藥物至關(guān)重要[16-18]。本實(shí)驗(yàn)中采用了由奧硝唑，環(huán)丙沙星和米諾環(huán)素組成的新型三重抗生素(傳統(tǒng)抗生素組成：甲硝唑、環(huán)丙沙星和米諾環(huán)素[19])。其中奧硝唑作為第三代硝基咪唑類藥物，具有對厭氧菌和原核生物的廣譜殺菌作用，其作用較甲硝唑強(qiáng)，有很強(qiáng)的滲透性，可以深入滲透根管系統(tǒng)，深層次作用于殘余細(xì)菌；米諾環(huán)素有和四環(huán)素類似的抗菌譜；環(huán)丙沙星可以抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的形成[20-23]。3種藥物的聯(lián)合使用能提高其抗菌效果。氫氧化鈣是目前臨床上最常用的消毒藥物，但對難治性根尖周炎效果欠佳[22 ,24]。本實(shí)驗(yàn)中用氫氧化鈣與新型三重抗生素配伍使用作用于糞腸球菌，觀察其對糞腸球菌致病毒力因子的影響。

本研究采用實(shí)時熒光定量PCR對糞腸球菌生物膜毒力因子gelE、cylA和esp的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在作用糞腸球菌生物膜時，TAP+CH、TAP和CH均顯著抑制毒力因子gelE、cylA和esp的表達(dá)；TAP+CH和TAP對這三種毒力基因表達(dá)的抑制作用均強(qiáng)于CH。這可能與其對糞腸球菌相關(guān)毒力基因片段的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)進(jìn)行了干擾有關(guān)，從而能對糞腸球菌生物膜的形成起到一定的抑制作用。

糞腸球菌作為難治性根尖周炎的重要致病菌，它可以在根管內(nèi)形成生物膜，使其難于被清除，而釋放的毒力因子使根尖周病變久不愈合。本研究結(jié)果可為防治難治性根尖周炎的發(fā)生提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但三重抗生素聯(lián)合氫氧化鈣對其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。