周 坤，高溫杰，李 宏

組織氧供減少或不能充分利用氧，導致組織代謝、功能和形態(tài)結構異常變化的病理過程稱為缺氧。當健康人進入高海拔或其他低氧環(huán)境時，時常發(fā)生缺氧[1,2]。不能迅速適應缺氧會導致肺水腫、心腦血管功能障礙，甚至死亡[1,3-5]。肺的炎性反應被認為是缺氧肺損傷主要的病理生理機制之一。而H1受體介導的炎性反應被認為參與肺損傷的形成過程[6-8]，其機制可能為激活的H1受體能加速生成活性氧簇，并誘導中性粒細胞及多種炎性因子的聚集[9]。富馬酸氯馬斯汀(clemastine fumarate, CLE)作為H1受體拮抗藥已被證實在肺缺血再灌注損傷后可抑制多種炎性介質的表達，抑制細胞凋亡，起到肺保護作用。但其在急性高原缺氧肺損傷中能否發(fā)揮同樣的作用目前仍沒有確切證據(jù)。因此，本實驗擬將CLE用于大鼠急性高原肺損傷模型，以探討CLE對該模型的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 富馬酸氯馬斯汀注射液購自華潤雙鶴利民藥業(yè)(濟南)有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司)；蘇木精-依紅染色試劑盒、Western配膠試劑盒、DAB濃縮試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；TRIzon總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒(江蘇康為世紀生物科技有限公司)；山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗、IL-1β抗體、TNF-α抗體、TLR4抗體、NF-κB抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)；PCR引物序列由生工生物工程公司合成。NanoPhotometer-NP80超微量紫外分光光度計(德國implen公司)；ABI 7500 RT-PCR 儀(美國ABI 公司)；DS850-I動物實驗艙(山東濰坊華信氧業(yè)有限公司)。

1.2 動物分組及模型制備 無特定病原體級8周齡雄性SD大鼠40只，單只體重200～220 g，由中國食品藥品檢定研究所提供，合格證號為SCXK(京)2017-0005。適應性喂養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法將無特定病原體級8周齡雄性SD大鼠分為對照組(C組)、缺氧組(HH組)、地米組(DXM組)、治療組(CLE組)，每組10只。將HH組、DXM組、CLE組放入動物實驗艙，設定海拔為7000 m、氧濃度為10%，DXM組從入艙前1 h開始以每6 h肌內注射2 mg/kg DXM，CLE組入艙前2 h按0.9 mg/kg肌內注射CLE，入艙10 h后追加一次用藥，劑量仍為0.9 mg/kg，完成造模。對照組不進行任何干預。造模結束后立即處死大鼠，觀察肺組織大體情況，而后取肺組織留用。本研究已通過武警特色醫(yī)學中心倫理委員會審批。

1.3 肺濕/干重比測定 取右肺上葉，0.9%氯化鈉注射液沖洗后用濾紙吸去組織表面液體，稱重3次后取平均值即為濕重，隨后放入65 ℃恒溫烘箱中烘干48 h后稱重3次，取平均值即為干重，計算肺濕/干重比。

1.4 蘇木精-伊紅(HE)染色 取右肺下葉，4%多聚甲醛固定48 h。經常規(guī)脫水、石蠟包埋后5 μm厚度切片，進行HE染色并在光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.5 反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) 取100 mg肺組織，用Trizon提取細胞中的總RNA, 超微量紫外分光光度計測定RNA純度，將RNA濃度標定為1000～2000 ng/μl，A260/A280標定在1.8～2.0，A260/A230>2；根據(jù)反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應,以反轉錄所得cDNA為模板,進行RT-PCR實驗。反應條件:95 ℃條件下預變性10 min,然后95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸32 s,共計40個循環(huán)。以β-actin為內參，以2-ΔΔCt來表示mRNA相對表達量。各引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 蛋白質印跡法(Western blot，WB) 在1 ml RIPA組織細胞裂解液中分別加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑各1 μl，取適量肺組織，提取總蛋白，用Bradford法蛋白濃度測定試劑盒測定濃度并定量。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白，以80 V恒壓電泳45 min至上層膠結束后繼續(xù)以120 V恒壓電泳至下層膠結束。4 ℃層析冷柜中90 V恒壓下轉膜60 min，將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜上。PVDF膜于3%脫脂奶粉中封閉3 h。漂洗后加一抗(β-actin 1∶1 000、IL-1β 1∶300、TNF-α 1∶500、TLR4 1∶500、NF-κB 1∶500)4 ℃條件下孵育過夜。TBST再次漂洗后室溫下加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)孵育2.5 h，漂洗后顯影。用Image Lab軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參β-actin蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠肺組織濕/干重比結果比較 HH組大鼠肺組織濕/干重比明顯高于其余3組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DXM組和CLE組大鼠肺組織濕干比比較差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 四組大鼠肺組織濕/干重比結果比較(n=10)

2.2 各組大鼠肺組織病理學改變 肺組織大體標本觀察：C組大鼠肺組織表面光滑、完整；HH組大鼠肺組織可見水腫明顯，表面可見散在點、片狀出血灶：DXM組和CLE組大鼠肺組織標本可見輕微水腫，表面偶見點狀出血灶。肺組織HE染色后觀察：C組肺組織無明顯病理改變；HH組肺組織可見大量炎性細胞浸潤，肺泡壁毛細血管擴張、充血明顯，肺泡間隔增厚，肺泡結構破壞無序、不張、融合、塌陷；DXM組和CLE組損傷程度較HH組輕(圖2)。

圖2 四組大鼠肺組織病理學檢測結果比較(HE,×400)

2.3 IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA表達的比較 與C組相比，HH組中IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA轉錄水平均明顯升高(均P<0.05)。與HH組相比，DXM組和CLE組中IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB 的mRNA轉錄水平均明顯降低(均P<0.05，表2)。

表2 四組大鼠肺組織IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA表達量比較

2.4 IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB 蛋白表達的比較 與C組相比，HH組中IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB 蛋白表達水平均明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與HH組相比，DXM組和CLE組中IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB 蛋白表達水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3，表3)。

圖3 四組大鼠肺組織中IL-1β、TNF-α、

表3 四組大鼠肺組織IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB 蛋白表達量比較

3 討 論

本研究使用實驗動物艙模擬大鼠在7000 m海拔環(huán)境下機體缺氧狀態(tài)24 h后，肺組織W/D較C組明顯升高，病理學較C組發(fā)生明顯損傷性改變，提示造模成功。本研究根據(jù)CLE使用說明書所提供藥物使用劑量及血藥濃度達峰時間，按照體表面積進行換算后，確定CLE的給藥劑量。本研究結果表明，給與CLE后，大鼠肺組織W/D較HH組明顯降低，肺組織病理損傷較HH組明顯減輕，缺氧引起的細胞通路蛋白及炎性因子的mRNA及蛋白表達均明顯降低，提示CLE可減輕高原缺氧引起的肺損傷。而文獻[10]表明DXM是迄今為止預防和治療高原缺氧肺損傷炎性反應最常用的藥物，本研究發(fā)現(xiàn)，DLE的治療作用與DXM相當。

根據(jù)高原缺氧肺損傷的經典病理生理學理論，急性缺氧引起肺部血管收縮，導致肺部血液重新流入收縮較小的血管(即導致“應力衰竭”)和肺泡-毛細血管屏障的物理破壞。同時，缺氧可以通過激活肺泡巨噬細胞中的TLR4信號通路來加劇肺損傷的炎癥反應，并在肺損傷的發(fā)展過程中進一步破壞肺泡-毛細血管屏障[11]。

TLR4是一種跨膜蛋白，主要分布于單核巨噬細胞表面，屬于膜識別受體家族，活化后可介導并參與細胞內信號傳導通路誘導炎性細胞出現(xiàn)相關免疫應答，是參與免疫應答的關鍵調節(jié)因子[12]。TLR4在橋接缺氧和炎癥之間的相互作用中起著至關重要的作用[11]。NF-κB作為TLR4通路下游的分子，是一種重要的轉錄因子，可特異性結合多種基因啟動子中的κB位點，調控免疫應答及多種炎性介質基因的表達[13]。NF-κB在生理狀態(tài)下與其抑制蛋白IκB結合以無活性狀態(tài)存在于細胞質中[14，15]，當TLR4被激活后，使IκB激酶激活，促使激活的NF-κB進入細胞核并激活炎癥信號通路，引起TNF-α、IL-1β等多種炎性因子表達[14]，啟動機體的免疫應答。也有研究報道TLR4通過髓樣分化應答基因依賴性通路的激活最終誘導NF-κB活化產生TNF-α、IL-1β等促炎因子加重肺損傷[16]。另有研究表明，NF-κB還可作為缺氧應答轉錄因子[17]直接調節(jié)炎性細胞反應繼而參與肺損傷過程[18]。因此，TLR4/NF-κB通路作為組織缺氧和急性肺損傷的中央環(huán)節(jié)，在缺氧肺損傷后的炎癥發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。本研究結果也提示，HH組肺組織中IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA轉錄水平及蛋白表達水平較C組明顯升高。

H1受體是組胺受體的一種亞型，在支氣管平滑肌和肺內皮細胞高表達。H1受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，其激活可通過Gαq/11和Gβγ亞基介導NF-κB活化，同時，還可通過上調TLR4的表達活化NF-κB[19，20]。CLE作為新型二代抗組胺藥已廣泛用于臨床。本研究試圖通過已知機制，來論證CLE是否具有減輕高原缺氧造成的肺損傷。研究結果顯示，CLE可以明顯減輕大鼠缺氧后肺水腫程度，IL-1β、TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA轉錄水平及蛋白表達水平較HH組有明顯降低，且降低程度和DXM組相當，CLE組和DXM組組間比較未見統(tǒng)計學差異，說明CLE的療效和DXM相仿。

綜上所述，本研究通過構造高原缺氧肺損傷大鼠模型，從抑制組胺受體活化以抑制炎性反應的角度探討了CLE的肺保護作用，發(fā)現(xiàn)CLE可能是通過抑制TLR4/NF-κB通路從而抑制肺的炎性反應。提示我們未來CLE作為高原缺氧肺損傷治療藥物的可能性。