蔡文璽，李 浩，石 磊，張 磊

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病，尤其是2型糖尿病所致的慢性腎臟疾病，是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，最終可發(fā)展為終末期腎病 (end-stage renal disease，ESRD)[1-2]。根據(jù)2019中國(guó)糖尿病腎病防治指南，與未合并DN的糖尿病患者相比，DN患者的死亡率更高，且大部分死亡是由于心血管事件導(dǎo)致[3]。然而，盡管一些治療方法可以緩解糖尿病腎病的癥狀，包括嚴(yán)格控制血糖、血壓，給予血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)等，但療效仍不理想[4，5]。而作為中藥復(fù)方制劑的蓯蓉益腎顆粒主要由五味子、菟絲子、肉蓯蓉、茯苓、車前子、巴戟天等中草藥制成，具有補(bǔ)腎填精之功效[6-8]，在DN的治療中有著積極的作用，但是其主要藥效成分、作用機(jī)制仍不明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略，預(yù)測(cè)了蓯蓉益腎顆粒治療DN的作用機(jī)制，揭示藥物與生物系統(tǒng)相互作用的內(nèi)涵，有助于理解中藥整體的多靶點(diǎn)、多途徑網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同調(diào)控模式，為中藥活性成分的篩選及其多靶點(diǎn)作用機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蓯蓉益腎顆粒主要化學(xué)成分的收集和篩選 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP)[9]，以 “五味子”、“菟絲子”、“肉蓯蓉”、“茯苓”、“車前子”、“巴戟天”為關(guān)鍵詞檢索蓯蓉益腎顆粒中的化學(xué)成分。結(jié)合藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄的相關(guān)性質(zhì)及TCMSP中建議的篩選標(biāo)準(zhǔn)，以口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18為限制進(jìn)行活性成分的篩選。

1.2 蓯蓉益腎顆粒主要化學(xué)成分潛在作用靶點(diǎn)的收集 借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索上述所有候選活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步篩選，通過輸入靶蛋白名稱，并限定物種為“Homo sapiens”，剔除非人源靶點(diǎn)，將所有蛋白名校正為其官方名稱。

1.3 DN疾病靶點(diǎn)的收集 以“diabetic nephropathy”、“diabetic kidney disease”為關(guān)鍵詞分別檢索TTD[10], OMIM[11], DisGeNET[12], Drugbank[13], PharmGkb[14], CTD[15], Genecard[16]等數(shù)據(jù)庫(kù)，去除重復(fù)基因，得到疾病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.4 生物分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 基于上述靶點(diǎn)信息，通過Cytoscape 3.7.1[17]軟件構(gòu)建中藥-成分、主要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，從而顯示中藥多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

比對(duì)主要活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)，確定靶點(diǎn)交集，借助STRING v10.5數(shù)據(jù)庫(kù)[18]構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，尋找靶點(diǎn)和靶點(diǎn)間作用關(guān)系。通過Network Analyzer對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮匦苑治觯ǘ?、介?shù)中心度(betweenness centrality, BC)和接近中心度(closeness centrality, CC)，選取大于上述參數(shù)中位數(shù)的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，其在網(wǎng)絡(luò)中信息傳遞效率更高，能影響更多節(jié)點(diǎn)，在網(wǎng)絡(luò)中作用顯著。

1.5 信號(hào)通路富集分析 采用Cytoscape 3.7.1軟件插件ClueGO[19]對(duì)上述靶基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號(hào)通路富集分析，綜合預(yù)測(cè)蓯蓉益腎顆粒與DN關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)過程及調(diào)控通路，基于富集結(jié)果的P值，以P<0.05為篩選條件，P<0.01被認(rèn)為是顯著富集，根據(jù)從小到大的順序?qū)值進(jìn)行排序。

2 結(jié) 果

2.1 蓯蓉益腎顆粒主要化學(xué)成分的收集和篩選 首先，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蓯蓉益腎顆粒主要化學(xué)成分進(jìn)行檢索，根據(jù)OB(≥30%)與DL(≥0.18)閾值，最終共得出69個(gè)活性成分(圖1)。其中，五味子8個(gè)，菟絲子11個(gè)，肉蓯蓉6個(gè)，茯苓15個(gè)，車前子9個(gè)，巴戟天20個(gè)，見圖1。

圖1 蓯蓉益腎顆粒主要化學(xué)成分網(wǎng)絡(luò)

2.2 蓯蓉益腎顆粒主要化學(xué)成分潛在作用靶點(diǎn)的收集 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到蓯蓉益腎顆?；瘜W(xué)成分對(duì)應(yīng)的1117個(gè)作用靶點(diǎn)，其中五味子30個(gè)，菟絲子343個(gè)，肉蓯蓉223個(gè)，茯苓30個(gè)，車前子195個(gè)，巴戟天296個(gè)，通過Cytoscape3.7.1軟件將蓯蓉益腎顆粒主要化學(xué)成分與靶點(diǎn)相連，繪制出“中藥活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”可視化相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

該網(wǎng)絡(luò)由269個(gè)節(jié)點(diǎn)和549條邊組成，且普遍存在1個(gè)活性成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)以及多個(gè)活性化學(xué)成分對(duì)應(yīng)1個(gè)靶點(diǎn)的現(xiàn)象，從而說明了蓯蓉益腎顆粒治療作用的多靶點(diǎn)屬性。而潛在靶點(diǎn)PTGS2、NCOA2、PTGS1、HSP90AA1、PIK3CG等因較高的自由度在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用，這也表明了蓯蓉益腎顆粒在發(fā)揮藥效過程中不同成分間的綜合協(xié)同作用模式。

2.3 DN疾病靶點(diǎn)的收集 通過TTD、OMIM、DisGeNET、Drugbank、PharmGkb、CTD、Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)收集DN相關(guān)靶點(diǎn)基因，去除重復(fù)基因，共得到311個(gè)疾病對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

2.4 生物分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 比對(duì)主要活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)，取其靶點(diǎn)交集，共得到81個(gè)活性成分和DN疾病共有靶點(diǎn)。通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI，尋找靶點(diǎn)和靶點(diǎn)間作用關(guān)系。通過Network Analyzer對(duì)PPI網(wǎng)路進(jìn)行分析得，BC中位數(shù)為0.002827，CC中位數(shù)為0.6093，度的中位數(shù)為30.5?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選方法，篩選上述拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)值大于中位數(shù)的靶基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，共37個(gè)，見表1。

2.5 信號(hào)通路富集分析 采用ClueGO插件對(duì)上述關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路富集分析，綜合預(yù)測(cè)蓯蓉益腎顆粒與DN關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)特性及調(diào)控通路。

GO富集分析表明，蓯蓉益腎顆?？赡芡ㄟ^對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞增殖等352個(gè)顯著生物過程發(fā)揮作用。KEGG功能注釋富集分析提示，該中藥復(fù)方可能作用的信號(hào)通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、癌癥途徑、Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等94個(gè)。上述信息表明，蓯蓉益腎顆?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)多個(gè)生物過程及多個(gè)通路的協(xié)調(diào)發(fā)揮治療DN的作用。同時(shí)，KEGG富集顯示疾病之間的調(diào)控機(jī)制存在相互聯(lián)系、相互影響的關(guān)系。富集分析表明，包括不同類型的病毒感染、乙型肝炎、恰加斯病(美國(guó)錐蟲病)、百日咳、弓形蟲病等疾病也被顯著富集。進(jìn)一步對(duì)KEGG富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

表1 蓯蓉益腎顆粒治療DN關(guān)鍵靶點(diǎn)

3 討 論

DN是糖尿病患者最重要的合并癥之一，目前已成為終末期腎臟病的第二位原因，僅次于腎小球腎炎。中醫(yī)理論認(rèn)為，DN歸屬為中醫(yī)“消渴”、“水腫”等范疇，其基本病機(jī)為氣陰兩虛，消渴日久，燥熱傷陰，陰損及陽。故在治療上多以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀等方法進(jìn)行治療[20]。中藥復(fù)方蓯蓉益腎顆粒主要由肉蓯蓉、五味子、菟絲子、茯苓、車前子、巴戟天等中草藥制成。其中，肉蓯蓉甘酸咸溫，既能補(bǔ)腎壯陽，又能益精填髓，為君藥；巴戟天辛甘微溫，補(bǔ)益腎氣，強(qiáng)筋壯骨，菟絲子辛甘平，滋補(bǔ)腎陰，固精養(yǎng)血，滋補(bǔ)腎陰，二者共為臣藥，增強(qiáng)肉蓯蓉之補(bǔ)益腎氣之力，特別是菟絲子多糖還具有較好的降血糖作用[21]；五味子能斂肺益腎，固攝精微，茯苓甘平，健脾滲濕利水，二者合而為佐藥；車前子甘寒通淋，利水消腫，以制五味子、菟絲子過于澀精，且引諸藥入腎，為使藥；全方共奏補(bǔ)腎填精，滋陰補(bǔ)氣之功效。

本研究旨在探索蓯蓉益腎顆粒潛在的分子生物學(xué)機(jī)制，通過比對(duì)主要活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建主要成分靶點(diǎn)與DN疾病靶點(diǎn)交集的PPI網(wǎng)絡(luò)，最終篩選得到37個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括AKT1、IL-6、TNF、VEGFA等。有研究表明，AKT1是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其異常表達(dá)和激活可引起過度的細(xì)胞外基質(zhì)在間質(zhì)沉積，啟動(dòng)并維持DN慢性腎纖維化發(fā)生發(fā)展[22]； IL-6、TNF-α及VEGFA是2型糖尿病腎病發(fā)生的重要炎癥反應(yīng)介質(zhì)，病理情況下，高水平的VEGFA及 IL-6、TNF-α等炎性因子的釋放過度，造成了腎小球病理變化加劇，其組織功能和結(jié)構(gòu)也發(fā)生了異常變化[23]。

生物過程及信號(hào)通路富集共篩選出94條顯著信號(hào)通路及352個(gè)顯著生物過程，表明蓯蓉益腎顆粒可能通過對(duì)炎癥反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡、細(xì)胞增殖等生物過程，以及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、癌癥途徑、Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等多個(gè)信號(hào)通路協(xié)同發(fā)揮治療DN的作用，這些信號(hào)通路及生物過程目前已經(jīng)證明與DN相關(guān)。AGE-RAGE信號(hào)通路是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要一環(huán)，其在糖尿病腎病中的作用機(jī)制體現(xiàn)在激活NF-κB，引起大量黏附分子、生長(zhǎng)因子、促炎細(xì)胞因子(如IL -6、IL-8、TNF-α) 等的表達(dá)和釋放，最終引起慢性細(xì)胞活化和組織損傷[24]，該通路還可刺激產(chǎn)生VEGF，從而增加血管的通透性，引起蛋白尿。而DN是一種代謝紊亂引起的炎性反應(yīng)疾病，炎癥因子的釋放增多可促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管纖維化，最終導(dǎo)致腎小球硬化加速[25]。其中，TNF-α 是一種重要的多功能免疫細(xì)胞因子，參與許多炎性、傳染性和自體免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展過程[26]。它還可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌IL-6、IL-1β等炎癥因子，從而進(jìn)一步放大或間接增強(qiáng)其毒性作用[27]。 臨床研究結(jié)果顯示，蓯蓉益腎顆粒在降低血糖的同時(shí)，可顯著降低患者血清TNF-α、IL-6等炎癥因子水平[6]。這也佐證了蓯蓉益腎顆?？赡苁峭ㄟ^干預(yù)人體AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路，參與到炎性反應(yīng)生物過程來控制和改善DN患者的病情。

另外，生物過程和信號(hào)通路富集分析顯示，蓯蓉益腎顆粒也可以參與到對(duì)活性氧的反應(yīng)、氧化應(yīng)激生物過程之中。研究表明，機(jī)體高活性分子活性氧簇ROS產(chǎn)生過多，超出了機(jī)體對(duì)氧化物的清除能力，可以引起腎小球基底膜結(jié)構(gòu)改變、腎小球毛細(xì)血管通透性增高，最終導(dǎo)致腎小球纖維化，使腎臟的損害更加嚴(yán)重，促進(jìn)DN的發(fā)生和發(fā)展[28-30]。有報(bào)道稱，蓯蓉益腎顆?？筛纳瓢螂最i部位肌肉細(xì)胞內(nèi)線粒體的能量代謝功能，增強(qiáng)尿道內(nèi)括約肌的收縮力，同時(shí)對(duì)機(jī)體交感祌經(jīng)的損傷也有一定的保護(hù)作用，從而達(dá)到改善腎功能的作用[31]。

本研究基于模塊化網(wǎng)絡(luò)分析對(duì)蓯蓉益腎顆粒作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探索，通過已有研究結(jié)果也證明了其預(yù)測(cè)相關(guān)生物過程及信號(hào)通路的準(zhǔn)確性。根據(jù)研究結(jié)果分析，其藥理機(jī)制可能是通過控制血糖濃度，影響AGEs-RAGE 、TNF、Toll樣受體等多信號(hào)通路，調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過程而干預(yù)DN。本研究為更快、更好地理解蓯蓉益腎顆粒的作用機(jī)制提供了一條有效的途徑，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了理論支持，并可以從分子水平的功能模塊來說明中醫(yī)“協(xié)同”的科學(xué)內(nèi)涵。