時小淋,王曉豐，劉 鵬,程艷杰，王明義

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院a中心實驗室; b消化內(nèi)科，山東威海 264200;2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科， 遼寧大連 116000 )

在人體血液循環(huán)中約70%的白細(xì)胞為中性粒細(xì)胞，正常人骨髓每天可生成大量、新鮮的中性粒細(xì)胞[1]，作為先天免疫系統(tǒng)的“先頭部隊”，其在機(jī)體抵御病原微生物的入侵中起著重要作用[2]。中性粒細(xì)胞“身兼”著趨化、吞噬、殺菌等多種功能，在機(jī)體被病原體感染后，能在多種趨化因子的作用下，逐漸向感染部位遷移，并通過多種途徑對病原體進(jìn)行誘殺，因此其免疫調(diào)節(jié)作用不容忽視[3]。目前普遍認(rèn)為中性粒細(xì)胞的殺菌機(jī)制主要包括：活性氧殺菌途徑、脫顆粒殺菌途徑和胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(Neutrophil Extracellular Traps, NETs)途徑[4]。若殺菌途徑缺陷或被抑制， 機(jī)體會發(fā)生反復(fù)感染；但若盲目加強(qiáng)殺菌作用，其過度激活也會損傷機(jī)體，引起多種自身免疫性疾病等，因此本文就中性粒細(xì)胞殺菌機(jī)理的最新研究進(jìn)展作以綜述，以期為后續(xù)中性粒細(xì)胞過度激活后的作用途徑以及靶點(diǎn)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 活性氧殺菌途徑

1.1 活性氧殺菌途徑的組成 中性粒細(xì)胞的活性氧殺菌途徑可大致分為兩種：一種是由髓過氧化物酶(MPO)，H2O2和血漿或細(xì)胞內(nèi)的Cl-，I-(鹵族化合物)組成；另一種是由于6磷酸葡萄糖氧化旁路(HMP)的代謝加快，O2在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶作用下接受NADPH上的一個電子后，還原為超氧物陰離子(·O2-)，生成氫氧自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(1O2)[6]。其中·O2，·OH，H2O2和1O2又被稱為活性氧(ROS)[7]。

1.2 活性氧殺菌途徑的作用機(jī)理 中性粒細(xì)胞的活性氧殺菌途徑，總體來說指的是ROS的殺菌作用以及MPO與H2O2在鹵族元素等因子的作用下形成醛后形成的高效殺菌作用[5]。

被病原體激活后的中性粒細(xì)胞會發(fā)生“呼吸爆炸”，耗氧量增加至數(shù)倍甚至數(shù)十倍[5-6]，宿主細(xì)胞吞噬病原體時，中性粒細(xì)胞質(zhì)膜部分內(nèi)陷，將病原體吞入細(xì)胞后形成吞噬小體，由于局部質(zhì)膜的構(gòu)象改變，導(dǎo)致原本無活性的NAD(P)H氧化酶被激活，然后催化氧分子變?yōu)椤2-[5-7]?！2-又在脂質(zhì)上形成過氧化物而破壞生物膜。·O2-除了能直接攻擊細(xì)菌外，其在細(xì)胞內(nèi)還能形成·OH，1O2和H2O2等物質(zhì)[7]?！H，1O2都是作用強(qiáng)烈的氧化劑，不僅可以氧化蛋白中的某些氨基酸殘基和碳水化合物，更能分解核酸，對致病菌也有極大的殺傷作用。而H2O2本身就有殺菌作用，還能與·O2-生成OH，1O2加強(qiáng)殺菌效果[8]。此外，中性粒細(xì)胞中含有的大量MPO能與H2O2，鹵族元素共同發(fā)揮殺菌作用，被稱為過-過-鹵系統(tǒng)，其作用機(jī)制是使氨基酸氧化脫羧，產(chǎn)生氨、醛類，同時造成病原體表面的氧化和鹵化，肽鏈被分裂，病原體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞[5]。

2 脫顆粒殺菌途徑

2.1 脫顆粒殺菌途徑的組成 中性粒細(xì)胞內(nèi)存在很多與殺菌有關(guān)的顆粒，分別為嗜天青顆粒、特異性顆粒和三級顆粒。中性粒細(xì)胞特有的顆粒為嗜天青顆粒，不僅含有大量MPO，還有一系列具有殺菌作用的中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶(NSPs)-組織蛋白酶G(CG)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)、蛋白酶3(PR3)和其他殺菌物質(zhì)[3-5]。特異性顆粒則含有乳鐵蛋白、溶酶體等。溶酶體中又有大量水解酶、溶酶蛋白等物質(zhì)。三級顆粒的特點(diǎn)是含有明膠酶[8-9]。

2.2 脫顆粒殺菌途徑作用機(jī)理 中性粒細(xì)胞的脫顆粒殺菌途徑主要指的是上述顆粒及其內(nèi)容物在殺傷致病菌中的作用[10]。已有文獻(xiàn)表明，NE不僅可破壞外膜蛋白A直接殺滅大腸埃希菌，還能裂解福氏志賀氏菌的某些遷移蛋白，防止福氏志賀氏菌進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。與此類似，CG能裂解金黃色葡萄球菌的黏附因子A。PR3則能切割hCAP-18生成抗菌肽LL-37。而在體內(nèi)，NE，CG和PR3共同發(fā)揮協(xié)同作用殺滅吞噬液泡內(nèi)的肺炎鏈球菌[11-12]。乳鐵蛋白不僅能結(jié)合鐵元素減少細(xì)菌對鐵的吸收，影響細(xì)菌的生長，還可與細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖結(jié)合，將細(xì)菌氧化使其裂解，還能夠針對H+-ATP酶并干擾胞膜上的質(zhì)子傳遞，從而對微生物造成致命的威脅[13-14]。此外，乳鐵蛋白還能夠參與ROS的產(chǎn)生[15]。溶酶體的抗菌譜雖窄，但是它能水解作為細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的肽鏈，以起到對某些革蘭氏陽性菌的殺傷作用[5]。

3 胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)途徑

3.1 胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)途徑的組成 中性粒細(xì)胞的NETs最初是由BRINKMANN等[16]發(fā)現(xiàn)。核酸物質(zhì)及顆粒蛋白構(gòu)成了NETs，DNA是NETs的主體部分，構(gòu)成了骨架以固定各種蛋白。嗜天青顆粒、特異性顆粒和三級顆粒，構(gòu)成了顆粒蛋白[17]。

3.2 胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)途徑的作用機(jī)理 NETs是以“自殺式”的模式殺滅病原體來保護(hù)機(jī)體，中性粒細(xì)胞的染色質(zhì)發(fā)生伸展、凝聚解體，核膜崩解后DNA及殺菌顆粒物質(zhì)釋放、黏附在解凝聚狀態(tài)的染色質(zhì)上，最終核膜破裂、中性粒細(xì)胞死亡，NETs被釋放出來[18]。

NETs的殺菌作用機(jī)制主要是通過以下兩點(diǎn)發(fā)揮作用的：①DNA形成的特殊骨架結(jié)構(gòu)能限制或延緩病原體在宿主體內(nèi)的傳播，起到了物理屏障作用；還能減少殺菌物質(zhì)的彌散，發(fā)揮了類似“富集”的效應(yīng)，增加了局部殺菌物質(zhì)的濃度；②中性粒細(xì)胞含有的各級顆粒也釋放出各種殺菌蛋白[19]。值得一提的是，NETs的殺菌作用是在中性粒細(xì)胞的吞噬作用開始前就已啟動，且在細(xì)胞死亡之后繼續(xù)發(fā)揮作用[20]。已有文獻(xiàn)報道，NETs能夠殺滅多種細(xì)菌、真菌，甚至是寄生蟲[21]。有趣的是，相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)，ROS的存在是NETs生成的前提[22]。

4 中性粒細(xì)胞殺菌途徑的缺失或抑制

中性粒細(xì)胞活性氧殺菌途徑在宿主抵抗致病菌侵襲的過程中發(fā)揮著重要作用，一旦此項殺菌功能缺失，將導(dǎo)致機(jī)體抵抗外界感染能力的銳減[23]。如人類遺傳病慢性肉芽腫(chronic granulomatous disease，CGD)，其特點(diǎn)是由于NADPH氧化酶的某種成分缺失而導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生缺乏，所以CGD患者的中性粒細(xì)胞的吞噬作用和脫顆粒功能雖正常, 但不能以正常速度殺死宿主細(xì)胞所吞入的細(xì)菌等，病人常出現(xiàn)頻繁而致命的感染[24]。

中性粒細(xì)胞脫顆粒殺菌途徑若缺失或被抑制，殺菌能力也將銳減。帕-勒氏綜合征(Papillon-Lefèvre syndrome，PLS)是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，其患者在出生一年后就表現(xiàn)出對細(xì)菌感染的發(fā)生率增加，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PLS患者的NSPs嚴(yán)重降低，患者的體外殺菌能力減弱[25]。慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者因其嗜天青顆粒和吞噬空泡不能發(fā)生融合，以至于無法產(chǎn)生H2O2，殺菌能力大幅度下降；而骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)患者部分或完全缺失顆粒內(nèi)含酶，這也是CML和MDS患者易被病原體感染的原因之一[5]。

多項實驗證實，NETs骨架可被脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)降解，能避免病原體被NETs捕捉殺滅[22,26]。BEITER等[26]人發(fā)現(xiàn)含有DNase的肺炎鏈球菌較普通菌株更易從上呼吸道擴(kuò)散到肺和血液當(dāng)中而引起肺炎，體外實驗證明用DNase抑制劑抑制了DNase的活性后，病原體的致病性明顯降低[22]。

5 中性粒細(xì)胞殺菌途徑的過度激活

中性粒細(xì)胞殺菌功能受損時，機(jī)體易受感染，但當(dāng)中性粒細(xì)胞被過度激活時，也會損傷組織，引起多種疾病[23]。對患有哮喘的大鼠肺組織進(jìn)行切片、染色后觀察，發(fā)現(xiàn)其支氣管壁及血管壁周圍MPO陽性的細(xì)胞明顯增多，說明MPO參與了哮喘的發(fā)病[27]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)ROS含量增加后，氧化應(yīng)激狀態(tài)即加重，機(jī)體血管內(nèi)皮發(fā)生損傷，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些因子在RA的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用[28]。此外，ROS升高后將導(dǎo)致DNA氧化、結(jié)構(gòu)改變，這會誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生，進(jìn)而誘發(fā)SLE等疾病[29]。

中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的過多NSPs也會對機(jī)體組織造成損傷，α1抗胰蛋白酶是人體內(nèi)重要的內(nèi)源性NSPs抑制劑，它能有效地抑制NE，CG的活性，其缺失與慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生密切相關(guān)[30]。DABEK等[31]人發(fā)現(xiàn)CG與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病相關(guān)，CG可以使腸上皮細(xì)胞頂側(cè)的蛋白酶激活受體-4(PAR-4)得到激活進(jìn)而導(dǎo)致上皮屏障被破壞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

NETs雖然有著強(qiáng)大的殺菌功能，但當(dāng)NETs生成的同時也會產(chǎn)生大量的自身抗原，若不及時去除也能對機(jī)體造成損傷[2]。囊性纖維病患者痰液中含有大量的DNA和彈性蛋白，在對患者采取吸入DNase療法后，患者的癥狀和肺功能得到了改善，提示NETs可能與疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[32]。流感病毒引起肺炎時，刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NETs，在破壞肺泡后引起肺泡毛細(xì)血管的彌漫性損傷，造成肺水腫，引起急性呼吸窘迫綜合征樣病理征象[2]。

6 展望

中性粒細(xì)胞是人體抵抗外界感染的重要免疫細(xì)胞，可以吞噬殺滅入侵的致病病原體，通過“呼吸爆發(fā)”、脫顆粒、NETs等途徑對病原體進(jìn)行誘殺，因此其免疫調(diào)節(jié)作用不容忽視。若中性粒細(xì)胞殺菌途徑缺陷或受抑制，將導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生反復(fù)且嚴(yán)重的感染，甚至致死。但若盲目加強(qiáng)中性粒細(xì)胞的殺滅病原體作用，以至于中性粒細(xì)胞被過度激活后，也會損傷機(jī)體，造成各種自身免疫性疾病等，但是對于中性粒細(xì)胞過度激活后具體的作用途徑以及作用靶點(diǎn)目前還尚未完全明確，因此對于明確此點(diǎn)對感染性疾病的治療具有極大的指導(dǎo)意義。因此臨床對于中性粒細(xì)胞的殺傷作用應(yīng)該合理利用，以達(dá)到對人體的最優(yōu)利用。