田會東，王靜，郭麗娜，賈明璐，陳雪平，王瑞

(1.河南省漯河市中心醫(yī)院藥學(xué)部，漯河 462000；2.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，漯河 462000)

近年來，隨著我國人口老齡化與生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病已經(jīng)從少見病變成一個流行病，2型糖尿病患病率持續(xù)攀升[1]。據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，我國成人糖尿病的患病率達10.9%，患病人數(shù)居世界之首[2]。2型糖尿病及其并發(fā)癥嚴重危害人類健康，并給社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。因此，抗2型糖尿病藥物的研究，已經(jīng)成為當今醫(yī)藥研究領(lǐng)域的熱點和難點。中藥因具有“多成分-多靶點-多通路”發(fā)揮整體協(xié)同作用的特點，在治療糖尿病及其并發(fā)癥等疾病方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。中醫(yī)認為，2型糖尿病及其并發(fā)癥是由于機體燥熱內(nèi)盛、煉液為痰、血流滯澀所致，治療應(yīng)以清熱燥濕、化痰通絡(luò)為主[3]。黃連是毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(CoptisteetaWall.)的干燥根莖，性寒、味苦，具有清熱潤燥的療效[4]；三七為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根和根莖，性溫、味甘，具有活血通絡(luò)之效[5]；二者配伍正體現(xiàn)清熱潤燥、益氣活血法治療“消渴癥”的基本方法。現(xiàn)代中醫(yī)臨床發(fā)現(xiàn)，黃連-三七在很多中藥處方中都有體現(xiàn)，是中醫(yī)治療糖尿病的常用藥對[6- 7]。然而，由于中藥多成分多靶點等特點，黃連-三七藥對抗2型糖尿病的作用機制尚未完全闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新的研究藥物作用機制的方法，廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的研究，為中藥作用機制的研究開辟了新的思路[8]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對“黃連-三七”藥對主要活性物質(zhì)、作用靶點及信號通路對其抗2型糖尿病的作用機制進行探索，旨在為黃連-三七抗2型糖尿病的進一步探索提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1篩選活性成分及相應(yīng)靶點 分別以黃連、三七為關(guān)鍵詞，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)(http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php) 中獲取所有化學(xué)成分。把口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18作為篩選條件[9]，從而得到活性成分。其中OB和DL是篩選活性成分的重要指標，OB、DL值越高，表明其越有可能被開發(fā)成為藥物[10-11]。活性成分的作用靶點從TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得，把靶點名稱輸入UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)，獲得其相應(yīng)靶點的人源的靶點基因名稱。

1.2構(gòu)建“活性成分-靶點蛋白”網(wǎng)絡(luò) 將黃連-三七藥對篩選出的活性成分和UniProt數(shù)據(jù)庫獲得的人源靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1版軟件，運用Network Analyzer插件分析構(gòu)建“活性成分-靶點蛋白”的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3構(gòu)建抗2型糖尿病靶點蛋白互作(protein protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò) 運用比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(comparative toxicogenomics database,CTD)(http：//ctdbase.org/)和治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database,TTD)(https：//db.idrblab.org/ttd/)，以“Type 2 Diabetes”為關(guān)鍵詞，檢索與2型糖尿病相關(guān)的靶點，將得到的靶點基因輸入STRING在線分析平臺(https：//string-db.org/)，選擇分值大于0.7(高置信度評分)[12]，預(yù)測靶點與靶點之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建抗2型糖尿病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4網(wǎng)絡(luò)合并 運用Cytoscape 3.6.1版軟件中的Merge功能將活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和抗2型糖尿病PPI網(wǎng)絡(luò)合并，觀察是否有交集網(wǎng)絡(luò)。有交集的蛋白靶點可能是抗2型糖尿病的關(guān)鍵靶點。

1.5通路富集分析 運用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對黃連-三七抗2型糖尿病靶點蛋白，進行基因的本體(gene ontology，GO)生物學(xué)過程富集分析和KEGG代謝通路富集分析，并以P<0.05作為篩選條件，結(jié)果用在線制圖平臺Omishare Tools可視化處理，進一步闡明靶點蛋白在信號通路中的作用。

2 結(jié)果

2.1主要活性成分 文獻[13]，皂苷類化合物口服，會被代謝生成次生皂苷或苷元，而真正在體內(nèi)發(fā)揮療效的多為次生苷或苷元。TCMSP 數(shù)據(jù)庫對此以“皂苷-qt”表示，為準確模擬化合物在體內(nèi)的真實情況，本研究對皂苷類化合物也以后綴qt 的形式進行描述。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共獲得167個黃連-三七對藥的已知成分，黃連成分有48個，三七成分有119個；以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為篩選條件獲得20個成分，其中黃連14個，三七7個，共有相同化合物1個。20個化合物中有3個化合物在TCMSP數(shù)據(jù)庫沒有篩選到相關(guān)作用靶點。因此，本研究共納入黃連-三七對藥的17個成分作為候選化合物，如表1所示。

2.2“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 從UniProt數(shù)據(jù)庫得到人源靶點基因共116個，將活性成分與作用靶點通過Cytoscape 3.6.1構(gòu)建成網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。圖1包含133個節(jié)點(17個活性成分和116個相關(guān)靶點)和261條線，其正八邊形代表活性成分，三角形代表相關(guān)靶點，線代表活性成分與相關(guān)靶點的關(guān)系。據(jù)報道，度值(degree)和介數(shù)值的節(jié)點(betweenness)與活性成分的重要性呈正相關(guān)，即其值越大，相應(yīng)的節(jié)點在此網(wǎng)絡(luò)圖中越重要[14]。結(jié)果顯示，槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、氫化小檗堿[(R)-canadine]等化合物和前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、前列腺素G/H合成酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、5α鈉通道蛋白、核受體激活劑2等靶點蛋白在網(wǎng)絡(luò)圖中具有樞紐作用，可能是關(guān)鍵的活性成分和靶點蛋白。這也充分說明了黃連-三七藥對是以多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。

表1 黃連-三七藥對篩選后得到的17個活性成分

圖1 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3抗2型糖尿病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在TTD數(shù)據(jù)庫檢索到抗2型糖尿病靶點75個，其中具有人源基因的靶點53個，在CTD數(shù)據(jù)庫中檢索到有直接證據(jù)來源的靶點211個，將這些靶點輸入STRING在線分析平臺，從而構(gòu)建抗2型糖尿病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。

2.4合并網(wǎng)絡(luò) 運用Cytoscape 3.6.1版軟件中的Merge功能將活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和抗2型糖尿病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)合并，獲得交集網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。從而得到黃連-三七藥對發(fā)揮抗2型糖尿病作用的化合物15個，包括槲皮素、β-谷甾醇、黃連堿、巴馬汀、小檗浸堿等；關(guān)鍵靶點19個，包括胰島素受體、前列腺素G/H合成酶2、二肽基肽酶IV、腸道麥芽糖酶-葡糖淀粉酶、凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ等，見表2。

圖2 抗2型糖尿病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5通路富集分析 運用DAVID平臺進行GO功能富集分析得到111個GO條目(P<0.05)，其中生物過程(biological process,BP)條目92個，細胞組成(cellular component,CC)條目12個，分子功能(molecular function,MF)相關(guān)的條目7個，見圖 4。KEGG通路富集，篩選出21條信號通路(P<0.05)，涉及HIF-1信號通路、胰島素抵抗通路、脂肪細胞脂解調(diào)控通路、PI3K-Akt信號通路等，見圖5。

圖3 抗2型糖尿病作用活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

其中準確度最高(P最小)的通路為HIF-1信號通路。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是由α和β亞單位組成一種異源二聚體，屬于轉(zhuǎn)錄因子堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族蛋白。HIF與細胞和組織內(nèi)的能量代謝有關(guān)，在缺氧條件下，可上調(diào)糖酵解途徑，降低線粒體功能來維持細胞代謝平衡，并且HIF還參與肝內(nèi)糖類和脂質(zhì)代謝[15]。由DAVID6.8平臺富集的HIF-1信號通路圖可知(圖6)，黃連-三七通過作用于EGFR、IL-6、HMOX1、bcl-2、NOS3、NOS2、INSR等7個靶蛋白調(diào)控HIF-1信號通路，起到抗2型糖尿病及其并發(fā)癥的作用。

表2 核心靶點信息

圖4 核心靶點GO富集分析

圖5 核心靶點GO富集分析

3 討論

中醫(yī)藥學(xué)有相對完備的理論基礎(chǔ)，在防治糖尿病方面具有優(yōu)勢，中藥能有效降低糖尿病的發(fā)病率已逐漸得到驗證[16]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了黃連-三七對藥抗2型糖尿病的主要活性成分及潛在分子作用機制。由抗2型糖尿病作用活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)可知，15種成分能對2型糖尿病的相關(guān)靶點產(chǎn)生作用，其中6種來自三七，10種來自黃連，槲皮素是黃連和三七的共有成分。據(jù)報道槲皮素具有顯著的降糖功效，可通過降低大鼠血清抵抗素從而改善胰島素抵抗，并對空腹血糖、空腹胰島素水平有直接降低作用[17]。這也為兩藥聯(lián)合抗2型糖尿病的合理性提供理論依據(jù)。

從交集網(wǎng)絡(luò)靶點可知，黃連-三七抗2型糖尿病是多靶點協(xié)同作用的結(jié)果。研究證實，IL-6可促進肝臟合成超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等急性時相蛋白，促進炎癥發(fā)生，是2型糖尿病的獨立影響因素之一[18]；抑制二肽基肽酶4(dipeptidyl-peptidase 4,DPP4)，可以阻斷對GLP-1的降解，因此增加了體內(nèi)內(nèi)源性GLP-1水平和活性，從而促進胰島素分泌[19]；過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)基因定位予3p25，屬于轉(zhuǎn)錄因子的核激素受體超家族，在調(diào)節(jié)胰島素敏感性方面具有重要作用[20]。這些研究報道部分預(yù)示著通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測黃連-三七藥對作用靶點和通路的可行性，可以把IL6、PTGS2、DPP4、SCD、PPARG等19個關(guān)鍵靶點作為黃連-三七抗2糖尿病的潛在作用靶點深入研究其分子作用機制。

圖6 HIF-1信號通路

從GO富集分析可知，靶點主要富集在BP(生物過程)環(huán)節(jié)，如氧化應(yīng)激，炎癥應(yīng)答，細胞對鎘離子反應(yīng)等；KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)HIF-1信號通路、胰島素抵抗通路、脂肪細胞脂解調(diào)控通路、PI3K-Akt信號通路等與2型糖尿病密切相關(guān)，其中胰島素抵抗通路直接與糖尿病相關(guān)，表明黃連-三七具有良好的抗2型糖尿病效果。HIF-1信號通路準確度最高(P=1.0×10-7)，是黃連-三七主要抗2型糖尿病途徑。研究表明，缺氧貫穿于糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機制的始終[21]。HIF-1α作為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵因子之一，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，對糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展起促進作用[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)黃連-三七能作用于HIF-1信號通路上EGFR、IL-6、HMOX1、bcl-2、NOS3、NOS2和INSR 7個靶點，證明黃連-三七的抗2型糖尿病作用可通過調(diào)控HIF-1信號通路實現(xiàn)。Akt是PI3K通路末端重要的靶蛋白，PI3K-Akt通路在胰島素調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)定方面發(fā)揮作用，孟昭杰[24]發(fā)現(xiàn)黃連素能上調(diào)糖尿病患者受損的Akt活性，促進GLUT4轉(zhuǎn)位，從而改善胰島素抵抗，這與本研究富集在PI3K-Akt通路的結(jié)論是吻合的。叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)是體內(nèi)一重要的轉(zhuǎn)錄因子，已證實與糖代謝密切相關(guān)[25]；據(jù)王水秀等[26]報道，NF-κB信號通路的活化與炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)；這些通路也可能是黃連-三七抗2型糖尿病的主要途徑之一。

本研究首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對“黃連-三七”藥對抗2型糖尿病的復(fù)雜機制進行了探究，成功預(yù)測了黃連-三七藥對抗2型糖尿病的主要活性成分、作用靶點和相關(guān)信號通路，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點、多通路的特點，為進一步深入探討作用機制奠定基礎(chǔ)，同時也為中藥復(fù)方治療2型糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供了借鑒。誠然，網(wǎng)絡(luò)藥理是一種新興的研究方法，本研究的結(jié)論仍存在局限性，尚需要基礎(chǔ)和臨床藥理試驗的進一步驗證。