田會(huì)東，王靜，郭麗娜，賈明璐，陳雪平，王瑞

(1.河南省漯河市中心醫(yī)院藥學(xué)部，漯河 462000；2.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，漯河 462000)

近年來(lái)，隨著我國(guó)人口老齡化與生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病已經(jīng)從少見(jiàn)病變成一個(gè)流行病，2型糖尿病患病率持續(xù)攀升[1]。據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)成人糖尿病的患病率達(dá)10.9%，患病人數(shù)居世界之首[2]。2型糖尿病及其并發(fā)癥嚴(yán)重危害人類健康，并給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，抗2型糖尿病藥物的研究，已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。中藥因具有“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”發(fā)揮整體協(xié)同作用的特點(diǎn)，在治療糖尿病及其并發(fā)癥等疾病方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)認(rèn)為，2型糖尿病及其并發(fā)癥是由于機(jī)體燥熱內(nèi)盛、煉液為痰、血流滯澀所致，治療應(yīng)以清熱燥濕、化痰通絡(luò)為主[3]。黃連是毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(CoptisteetaWall.)的干燥根莖，性寒、味苦，具有清熱潤(rùn)燥的療效[4]；三七為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根和根莖，性溫、味甘，具有活血通絡(luò)之效[5]；二者配伍正體現(xiàn)清熱潤(rùn)燥、益氣活血法治療“消渴癥”的基本方法?，F(xiàn)代中醫(yī)臨床發(fā)現(xiàn)，黃連-三七在很多中藥處方中都有體現(xiàn)，是中醫(yī)治療糖尿病的常用藥對(duì)[6- 7]。然而，由于中藥多成分多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，黃連-三七藥對(duì)抗2型糖尿病的作用機(jī)制尚未完全闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種新的研究藥物作用機(jī)制的方法，廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的研究，為中藥作用機(jī)制的研究開(kāi)辟了新的思路[8]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)“黃連-三七”藥對(duì)主要活性物質(zhì)、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路對(duì)其抗2型糖尿病的作用機(jī)制進(jìn)行探索，旨在為黃連-三七抗2型糖尿病的進(jìn)一步探索提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1篩選活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn) 分別以黃連、三七為關(guān)鍵詞，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)(http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php) 中獲取所有化學(xué)成分。把口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18作為篩選條件[9]，從而得到活性成分。其中OB和DL是篩選活性成分的重要指標(biāo)，OB、DL值越高，表明其越有可能被開(kāi)發(fā)成為藥物[10-11]?；钚猿煞值淖饔冒悬c(diǎn)從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，把靶點(diǎn)名稱輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.uniprot.org/)，獲得其相應(yīng)靶點(diǎn)的人源的靶點(diǎn)基因名稱。

1.2構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)蛋白”網(wǎng)絡(luò) 將黃連-三七藥對(duì)篩選出的活性成分和UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的人源靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1版軟件，運(yùn)用Network Analyzer插件分析構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)蛋白”的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3構(gòu)建抗2型糖尿病靶點(diǎn)蛋白互作(protein protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò) 運(yùn)用比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(comparative toxicogenomics database,CTD)(http：//ctdbase.org/)和治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database,TTD)(https：//db.idrblab.org/ttd/)，以“Type 2 Diabetes”為關(guān)鍵詞，檢索與2型糖尿病相關(guān)的靶點(diǎn)，將得到的靶點(diǎn)基因輸入STRING在線分析平臺(tái)(https：//string-db.org/)，選擇分值大于0.7(高置信度評(píng)分)[12]，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建抗2型糖尿病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4網(wǎng)絡(luò)合并 運(yùn)用Cytoscape 3.6.1版軟件中的Merge功能將活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和抗2型糖尿病PPI網(wǎng)絡(luò)合并，觀察是否有交集網(wǎng)絡(luò)。有交集的蛋白靶點(diǎn)可能是抗2型糖尿病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5通路富集分析 運(yùn)用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)黃連-三七抗2型糖尿病靶點(diǎn)蛋白，進(jìn)行基因的本體(gene ontology，GO)生物學(xué)過(guò)程富集分析和KEGG代謝通路富集分析，并以P<0.05作為篩選條件，結(jié)果用在線制圖平臺(tái)Omishare Tools可視化處理，進(jìn)一步闡明靶點(diǎn)蛋白在信號(hào)通路中的作用。

2 結(jié)果

2.1主要活性成分 文獻(xiàn)[13]，皂苷類化合物口服，會(huì)被代謝生成次生皂苷或苷元，而真正在體內(nèi)發(fā)揮療效的多為次生苷或苷元。TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)此以“皂苷-qt”表示，為準(zhǔn)確模擬化合物在體內(nèi)的真實(shí)情況，本研究對(duì)皂苷類化合物也以后綴qt 的形式進(jìn)行描述。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得167個(gè)黃連-三七對(duì)藥的已知成分，黃連成分有48個(gè)，三七成分有119個(gè)；以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為篩選條件獲得20個(gè)成分，其中黃連14個(gè)，三七7個(gè)，共有相同化合物1個(gè)。20個(gè)化合物中有3個(gè)化合物在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有篩選到相關(guān)作用靶點(diǎn)。因此，本研究共納入黃連-三七對(duì)藥的17個(gè)成分作為候選化合物，如表1所示。

2.2“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)得到人源靶點(diǎn)基因共116個(gè)，將活性成分與作用靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape 3.6.1構(gòu)建成網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。圖1包含133個(gè)節(jié)點(diǎn)(17個(gè)活性成分和116個(gè)相關(guān)靶點(diǎn))和261條線，其正八邊形代表活性成分，三角形代表相關(guān)靶點(diǎn)，線代表活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)的關(guān)系。據(jù)報(bào)道，度值(degree)和介數(shù)值的節(jié)點(diǎn)(betweenness)與活性成分的重要性呈正相關(guān)，即其值越大，相應(yīng)的節(jié)點(diǎn)在此網(wǎng)絡(luò)圖中越重要[14]。結(jié)果顯示，槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、氫化小檗堿[(R)-canadine]等化合物和前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、前列腺素G/H合成酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、5α鈉通道蛋白、核受體激活劑2等靶點(diǎn)蛋白在網(wǎng)絡(luò)圖中具有樞紐作用，可能是關(guān)鍵的活性成分和靶點(diǎn)蛋白。這也充分說(shuō)明了黃連-三七藥對(duì)是以多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。

表1 黃連-三七藥對(duì)篩選后得到的17個(gè)活性成分

圖1 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3抗2型糖尿病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到抗2型糖尿病靶點(diǎn)75個(gè)，其中具有人源基因的靶點(diǎn)53個(gè)，在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到有直接證據(jù)來(lái)源的靶點(diǎn)211個(gè)，將這些靶點(diǎn)輸入STRING在線分析平臺(tái)，從而構(gòu)建抗2型糖尿病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。

2.4合并網(wǎng)絡(luò) 運(yùn)用Cytoscape 3.6.1版軟件中的Merge功能將活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和抗2型糖尿病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)合并，獲得交集網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。從而得到黃連-三七藥對(duì)發(fā)揮抗2型糖尿病作用的化合物15個(gè)，包括槲皮素、β-谷甾醇、黃連堿、巴馬汀、小檗浸堿等；關(guān)鍵靶點(diǎn)19個(gè)，包括胰島素受體、前列腺素G/H合成酶2、二肽基肽酶IV、腸道麥芽糖酶-葡糖淀粉酶、凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ等，見(jiàn)表2。

圖2 抗2型糖尿病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5通路富集分析 運(yùn)用DAVID平臺(tái)進(jìn)行GO功能富集分析得到111個(gè)GO條目(P<0.05)，其中生物過(guò)程(biological process,BP)條目92個(gè)，細(xì)胞組成(cellular component,CC)條目12個(gè)，分子功能(molecular function,MF)相關(guān)的條目7個(gè)，見(jiàn)圖 4。KEGG通路富集，篩選出21條信號(hào)通路(P<0.05)，涉及HIF-1信號(hào)通路、胰島素抵抗通路、脂肪細(xì)胞脂解調(diào)控通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等，見(jiàn)圖5。

圖3 抗2型糖尿病作用活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

其中準(zhǔn)確度最高(P最小)的通路為HIF-1信號(hào)通路。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是由α和β亞單位組成一種異源二聚體，屬于轉(zhuǎn)錄因子堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族蛋白。HIF與細(xì)胞和組織內(nèi)的能量代謝有關(guān)，在缺氧條件下，可上調(diào)糖酵解途徑，降低線粒體功能來(lái)維持細(xì)胞代謝平衡，并且HIF還參與肝內(nèi)糖類和脂質(zhì)代謝[15]。由DAVID6.8平臺(tái)富集的HIF-1信號(hào)通路圖可知(圖6)，黃連-三七通過(guò)作用于EGFR、IL-6、HMOX1、bcl-2、NOS3、NOS2、INSR等7個(gè)靶蛋白調(diào)控HIF-1信號(hào)通路，起到抗2型糖尿病及其并發(fā)癥的作用。

表2 核心靶點(diǎn)信息

圖4 核心靶點(diǎn)GO富集分析

圖5 核心靶點(diǎn)GO富集分析

3 討論

中醫(yī)藥學(xué)有相對(duì)完備的理論基礎(chǔ)，在防治糖尿病方面具有優(yōu)勢(shì)，中藥能有效降低糖尿病的發(fā)病率已逐漸得到驗(yàn)證[16]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)了黃連-三七對(duì)藥抗2型糖尿病的主要活性成分及潛在分子作用機(jī)制。由抗2型糖尿病作用活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可知，15種成分能對(duì)2型糖尿病的相關(guān)靶點(diǎn)產(chǎn)生作用，其中6種來(lái)自三七，10種來(lái)自黃連，槲皮素是黃連和三七的共有成分。據(jù)報(bào)道槲皮素具有顯著的降糖功效，可通過(guò)降低大鼠血清抵抗素從而改善胰島素抵抗，并對(duì)空腹血糖、空腹胰島素水平有直接降低作用[17]。這也為兩藥聯(lián)合抗2型糖尿病的合理性提供理論依據(jù)。

從交集網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)可知，黃連-三七抗2型糖尿病是多靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果。研究證實(shí)，IL-6可促進(jìn)肝臟合成超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等急性時(shí)相蛋白，促進(jìn)炎癥發(fā)生，是2型糖尿病的獨(dú)立影響因素之一[18]；抑制二肽基肽酶4(dipeptidyl-peptidase 4,DPP4)，可以阻斷對(duì)GLP-1的降解，因此增加了體內(nèi)內(nèi)源性GLP-1水平和活性，從而促進(jìn)胰島素分泌[19]；過(guò)氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)基因定位予3p25，屬于轉(zhuǎn)錄因子的核激素受體超家族，在調(diào)節(jié)胰島素敏感性方面具有重要作用[20]。這些研究報(bào)道部分預(yù)示著通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)黃連-三七藥對(duì)作用靶點(diǎn)和通路的可行性，可以把IL6、PTGS2、DPP4、SCD、PPARG等19個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)作為黃連-三七抗2糖尿病的潛在作用靶點(diǎn)深入研究其分子作用機(jī)制。

圖6 HIF-1信號(hào)通路

從GO富集分析可知，靶點(diǎn)主要富集在BP(生物過(guò)程)環(huán)節(jié)，如氧化應(yīng)激，炎癥應(yīng)答，細(xì)胞對(duì)鎘離子反應(yīng)等；KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)HIF-1信號(hào)通路、胰島素抵抗通路、脂肪細(xì)胞脂解調(diào)控通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等與2型糖尿病密切相關(guān)，其中胰島素抵抗通路直接與糖尿病相關(guān)，表明黃連-三七具有良好的抗2型糖尿病效果。HIF-1信號(hào)通路準(zhǔn)確度最高(P=1.0×10-7)，是黃連-三七主要抗2型糖尿病途徑。研究表明，缺氧貫穿于糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制的始終[21]。HIF-1α作為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵因子之一，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)黃連-三七能作用于HIF-1信號(hào)通路上EGFR、IL-6、HMOX1、bcl-2、NOS3、NOS2和INSR 7個(gè)靶點(diǎn)，證明黃連-三七的抗2型糖尿病作用可通過(guò)調(diào)控HIF-1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。Akt是PI3K通路末端重要的靶蛋白，PI3K-Akt通路在胰島素調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)定方面發(fā)揮作用，孟昭杰[24]發(fā)現(xiàn)黃連素能上調(diào)糖尿病患者受損的Akt活性，促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)位，從而改善胰島素抵抗，這與本研究富集在PI3K-Akt通路的結(jié)論是吻合的。叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)是體內(nèi)一重要的轉(zhuǎn)錄因子，已證實(shí)與糖代謝密切相關(guān)[25]；據(jù)王水秀等[26]報(bào)道，NF-κB信號(hào)通路的活化與炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)；這些通路也可能是黃連-三七抗2型糖尿病的主要途徑之一。

本研究首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)“黃連-三七”藥對(duì)抗2型糖尿病的復(fù)雜機(jī)制進(jìn)行了探究，成功預(yù)測(cè)了黃連-三七藥對(duì)抗2型糖尿病的主要活性成分、作用靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，為進(jìn)一步深入探討作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為中藥復(fù)方治療2型糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供了借鑒。誠(chéng)然，網(wǎng)絡(luò)藥理是一種新興的研究方法，本研究的結(jié)論仍存在局限性，尚需要基礎(chǔ)和臨床藥理試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。