周 琳 楊柳燕 蔡友銘 張 雪 張永春,*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所, 上海 201403；2 上海華宇西紅花種植專業(yè)合作社, 上海 202150)

西紅花(CrocussativusL.)，又名番紅花、藏紅花，是鳶尾科番紅花屬中具有藥用價(jià)值的多年生草本植物[1]。西紅花花絲(花柱和柱頭)作為傳統(tǒng)中藥具有活血化瘀、涼血解毒、消腫止痛、解郁安神等功效[2]，其特有的次生代謝產(chǎn)物，藏紅花素、藏紅花醛、藏紅花酸等[3]，具有抗腫瘤、抗炎、降血糖和血脂等功能[4]。除了藥用價(jià)值，西紅花還廣泛用于食品、飲料、湯料、香料、化妝品的著色和調(diào)味。因此，西紅花既是國內(nèi)外市場(chǎng)緊缺的名貴中藥材，又是重要的日用化工、食品香料原料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

西紅花原產(chǎn)于伊朗、西班牙、希臘等國家，目前在伊朗、西班牙、印度、日本、巴基斯坦等國家均有種植[5]。我國西紅花多從日本和德國引進(jìn)，現(xiàn)已在上海、浙江、北京、福建等地有一定栽培規(guī)模。上海崇明較早地引進(jìn)和種植西紅花，經(jīng)過30多年的栽培體系的摸索，已輻射華東地區(qū)近133 hm2[6]。西紅花原產(chǎn)地氣候多冷涼干燥，符合其生長習(xí)性，多年連續(xù)栽培，整個(gè)生長期(越夏、采花和越冬)均在田間[7]。然而，由于江浙滬地區(qū)夏季溫度和濕度較高，西紅花露地越夏期間病害發(fā)生嚴(yán)重，因此對(duì)西紅花種植方式進(jìn)行了改良，形成了“二段式”栽培方式，即室內(nèi)培育采花(6月至11月)和田間種球繁育(12月至次年5月)兩個(gè)階段[7-8]。研究表明，西紅花球莖與開花、新球莖形成和功能成分含量密切相關(guān)[7]。國內(nèi)外多關(guān)注于西紅花栽培體系的優(yōu)化和種球繁育，而在西紅花生產(chǎn)中，球莖腐爛病已造成西紅花產(chǎn)量和品質(zhì)下降[7]，因此其致病菌的分離鑒定及其防治藥物的篩選逐漸受到國內(nèi)外關(guān)注[9-12]。

西紅花屬于喜肥植物，在種植前使用大量的有機(jī)肥，在生長期間需多次追肥，在崇明已形成了水稻-西紅花輪作的模式。經(jīng)過長期的種植，西紅花栽培模式可能導(dǎo)致種植地土壤菌群多樣性與其他栽培地存在較多差異，但目前鮮有相關(guān)的報(bào)道。近年來，西紅花栽培企業(yè)和農(nóng)戶發(fā)現(xiàn)在西紅花種植過程中有不同程度的腐爛病發(fā)生，嚴(yán)重影響西紅花的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，本試驗(yàn)利用Illumina MiSeq測(cè)序方法開展崇明西紅花栽培地球莖和土壤微生物多樣性研究，以期為深入了解土壤和球莖菌群群落和豐度，制定合理可行的土壤滅菌和球莖殺菌方案和降低西紅花腐爛病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集與處理

本試驗(yàn)于2016年12月開展，隨機(jī)采集崇明島廟鎮(zhèn)4家西紅花種植戶的根際土壤和球莖，4家農(nóng)戶種植西紅花均采用西紅花-水稻輪作模式，栽培年限為6年。試驗(yàn)取樣前，已連續(xù)2年按照當(dāng)?shù)匚骷t花生產(chǎn)合作社的栽培技術(shù)規(guī)程進(jìn)行西紅花種植和水肥管理。在每個(gè)西紅花種植戶栽培地，均采用5點(diǎn)S形法挖取15～20 cm深度的土壤，取得的土壤去除西紅花根系等雜質(zhì)，將每個(gè)農(nóng)戶栽培地根際土壤混合為1個(gè)土壤樣本，共4份土壤樣本。取每個(gè)農(nóng)戶栽培地的健康且無病斑西紅花球莖3個(gè)，共4份西紅花球莖樣本。土壤和球莖樣本用冰盒保鮮帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 微生物多樣性分析

1.2.1 西紅花根際土壤和球莖中微生物總DNA的提取 參照Ambardar等[12]和Pang等[13]的方法。4份土壤樣本均分別提取3次DNA，并提取每個(gè)西紅花球莖微生物DNA。通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提出DNA的完整性，并利用Nanodrop 2000紫外可見分光光度計(jì)(Themo ScientificTM, Wilmington, DE, USA)檢測(cè)DNA濃度和純度，-80℃凍存高質(zhì)量的DNA(A260/A280比值范圍為1.8～2.0)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和MiSeq測(cè)序 西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS序列的引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增使用通用引物(520F和802R[14])；真菌基因擴(kuò)增引物為ITS1F(5′-G G A A G T A A A A G T C G T A A C A A GG-3′)和ITS1R(5′-G C T G C G T T C T T C A T C G A T GC-3′)。細(xì)菌和真菌PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序相同，均參照牛世全等[14]的方法。同一樣品均進(jìn)行3次PCR，PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用Axygen凝膠回收試劑盒(愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，杭州)對(duì)切取目的片段進(jìn)行回收。純化后的PCR產(chǎn)物由上海派森諾生物科技有限公司利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

首先采用滑動(dòng)窗口法對(duì)雙端序列進(jìn)行質(zhì)量初篩，然后利用FLASH軟件(Version 1.2.7)[15]對(duì)通過質(zhì)量初篩的雙端序列進(jìn)行拼接，最后運(yùn)用QIIME軟件(v1.8.0)[16]識(shí)別疑問序列，并通過QIIME軟件調(diào)用USEARCH(v5.2.236)檢查和剔除嵌合體序列。

使用QIIME軟件[17]調(diào)用序列比對(duì)工具UCLUST[15]對(duì)上述獲得的序列進(jìn)行歸并和OTU(operational taxonomic units)劃分(按97%的序列相似度)，選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。通過與Greengenes數(shù)據(jù)庫(細(xì)菌)[18]和Unite數(shù)據(jù)庫(真菌)[19]對(duì)比獲得OTU分類學(xué)信息。利用QIIME軟件[16]計(jì)算根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌的Alpha多樣性，基于Ⅰ-Sanger生信云平臺(tái)(https://www.i-sanger.com/)計(jì)算根際土壤和球莖中共有OTU數(shù)量，并繪制OTU-Venn圖和兩組間物種差異分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌的多樣性分析

由表1可知，西紅花根際土壤細(xì)菌和真菌的有效OTU數(shù)量分別為5 500和1 166，球莖細(xì)菌和真菌的OTU數(shù)量分別為433和300。根際土壤中細(xì)菌的ACE和Chao1豐富度指數(shù)分別為24 601和10 558，顯著高于球莖，表明西紅花根際土壤中細(xì)菌的群落豐富度高于球莖；根際土壤中真菌的ACE和Chao1豐富度指數(shù)分別為707和678，高于球莖，但兩者差異不顯著。根際土壤中細(xì)菌和真菌的Shannon多樣性指數(shù)均高于球莖，而Simpson多樣性指數(shù)均低于球莖，說明根際土壤中細(xì)菌和真菌的群落多樣性高于球莖。此外，西紅花根際土壤細(xì)菌和真菌組成較為豐富，而球莖中較少，其中根際土壤與球莖共有的細(xì)菌和真菌OTU數(shù)量分別為292和145，分別占球莖OTU總數(shù)的67.44%和48.33%；球莖中特有細(xì)菌OUT數(shù)量為141，特有真菌OUT數(shù)量為155(圖2)。綜上，西紅花根際土壤和球莖在細(xì)菌和真菌的組成、結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度上存在較大差異，且根際土壤的細(xì)菌和真菌群落的豐富度和多樣性均高于球莖。

2.2 西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

由表2可知，西紅花根際土壤和球莖中分別含有11和7個(gè)門類細(xì)菌菌群，二者細(xì)菌菌群豐度最高的均為變形菌門，分別為41.25%和42.06%。此外，酸桿菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門和Latescibacteria僅存在西紅花根際土壤中，球莖中未檢出。根際土壤和球莖中真菌均含有2個(gè)門類，分別為子囊菌門和擔(dān)子菌門。其中，根際土壤中主要是子囊菌門，相對(duì)豐度達(dá)86.25%，擔(dān)子菌門僅有2.40%；球莖中子囊菌門的相對(duì)豐度為39.85%，也明顯高于擔(dān)子菌門(7.11%)，但有53.03%未能分類。真菌統(tǒng)計(jì)顯示，根際土壤和球莖中分別含有5和6個(gè)綱類真菌菌群。其中，根際土壤中豐度最高的為糞殼菌綱(63.49%)，其次為座囊菌綱(12.28%)和散囊菌綱(5.64%)，傘菌綱(1.58%)和錘舌菌綱(0.70%)相對(duì)豐度較小；球莖中優(yōu)勢(shì)菌群為散囊菌綱(25.90%)，其次為錘舌菌綱(8.70%)和外擔(dān)菌綱(6.20%)，座囊菌綱(1.08%)和傘菌綱(0.84%)相對(duì)豐度較小。此外，外擔(dān)菌綱不存在于西紅花根際土壤中，只存在于球莖中，且相對(duì)豐度較高(6.20%)。

表1 西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌的多樣性指數(shù)Table 1 Diversity index of bacteria and fungi in rhizosphere soil and corm of saffron

圖1 西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌 和真菌OTUs-Venn圖Fig.1 OTUs-Venn graph of rhizosphere soil and corm in saffron

由圖2可知，從屬水平進(jìn)行分析，西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌群落組成和相對(duì)豐度存在明顯差異。西紅花根際土壤中細(xì)菌群落主要為厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)中未鑒定出的菌屬(10.33%)、酸桿菌屬(Acidobacteria，5.36%)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira，2.80%)、芽單胞菌屬(Gemmatimonadaceae，2.69%)和亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae)中未鑒定出的菌屬(2.27%)；球莖中主要為藍(lán)細(xì)菌綱(Cyanobacteria)中未鑒定出的菌屬(13.74%)、假單胞菌屬(Pseudomonas，12.20%)、放線孢菌屬(Actinomycetospora，9.11%)、鏈霉菌屬(Streptomyces，8.59%)和微桿菌屬(Microbacterium，6.69%)，且糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)和假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)菌群僅存在于球莖中，在根際土壤中未檢出。西紅花根際土壤中真菌群落主要為裂殼菌屬(Schizothecium，14.67%)、Myrmecridium屬(8.83%)、柄孢殼屬(Zopfiella，7.83%)、黃絲曲霉屬(Talaromyces，5.47%)和柄孢殼菌屬(Podospora，3.74%)；球莖中真菌與根際土壤明顯不同，豐度最高的為青霉菌屬(Penicillium，24.07%)，其次為背芽突霉屬(Cadophora，8.68%)、外擔(dān)菌屬(Exobasidium，6.20%)和曲霉屬(Aspergillus，1.73%)，其中背芽突霉屬(Cadophora)和曲霉屬(Aspergillus)在根際土壤中未檢出。

2.3 西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌種水平差異分析

通過Ⅰ-Sanger 生信云平臺(tái)分析根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌在種水平上的差異表達(dá)。由圖3可知，西紅花根際土壤中細(xì)菌相對(duì)豐度顯著高于球莖，在球莖中相對(duì)豐度極低，甚至未檢出；而藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、鏈霉菌(Streptomyces)、芽孢桿菌(Bacillus)和糖多孢菌(Saccharopolyspora)在球莖中的相對(duì)豐度顯著高于根際土壤，其中球莖和根際土壤的Cyanobacteria相對(duì)豐度分別為13.74%和0.16%，Streptomyces分別為8.26%和0.06%；球莖中芽孢桿菌、糖多孢菌的相對(duì)豐度分別是根標(biāo)土壤的11.73和291.91倍。由圖4可知，根際土壤和球莖中真菌在種水平上的差異表達(dá)與細(xì)菌規(guī)律相似，除了未分類的真菌，根際土壤中相對(duì)豐度較高的真菌在球莖中相對(duì)豐度基本低于0.001%，而球莖中相對(duì)豐度較高的真菌在根際土壤中的相對(duì)豐度基本低于0.013%。在球莖中大量檢測(cè)到Penicillium、Penicillium_roseopurpureum、Penicillium_steckii、Exobasidium_sp和Cadophora，相對(duì)豐度分別為7.86%、7.07%、6.64%和6.20%和5.65%，而根際土壤中基本均為0.01%左右。此外，Cadophora僅在西紅花球莖中檢出。

表2 細(xì)菌門類水平及真菌門類、綱類水平上的組成及相對(duì)豐度Table 2 Relative abundances and composition of bacterial taxa at the phylum level, fungi taxa at the phylum and class level /%

圖2 西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌群落在屬類水平上的組成及相對(duì)豐度Fig.2 Composition and relative abundances of bacterial and fungi taxa in rhizosphere soil and corm of saffron at genus level

圖3 西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌群落在種水平上的組成差異Fig.3 Compositional differences of bacterial taxa in rhizosphere soil and corm of saffron

圖4 西紅花根際土壤和球莖中真菌群落在種水平上的組成差異Fig.4 Compositional differences of fungal taxa in rhizosphere soil and corm of saffron

3 討論

有研究表明，崇明東灘濕地土壤中真菌主要為子囊菌門和擔(dān)子菌門，在綱水平上主要為糞殼菌綱、酵母菌綱和座囊菌綱，而傘菌綱和單子菌綱的多樣性相對(duì)較低，細(xì)菌主要為放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門[20-21]。本研究中，崇明廟鎮(zhèn)西紅花根際土壤真菌主要為子囊菌門和擔(dān)子菌門，在綱水平主要為糞殼菌綱和座囊菌綱，與黃斌[21]的研究結(jié)果一致；而本研究土壤細(xì)菌主要為變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門，這與崇明濕地土壤中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)存在較大差異。由此可見，西紅花栽培地土壤菌群多樣性與崇明其他栽培地存在一定的差異，這可能與西紅花栽培過程中缺乏統(tǒng)一田間管理技術(shù)規(guī)程有關(guān)，部分栽培區(qū)存在過量施肥的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致西紅花栽培地土壤中細(xì)菌多樣性與濕地土壤存在較大差異。

Ambardar等[11]研究了印度栽培地西紅花不同生長時(shí)期土壤中真菌的變化，發(fā)現(xiàn)土壤中除了檢測(cè)到子囊菌門和擔(dān)子菌門外，還檢測(cè)到接合菌門；在休眠期，接合菌門豐富(99.70%)，但在開花期幾乎不存在(0.80%)，而擔(dān)子菌門豐度從開花期的93.20%降至休眠期的0.05%。本研究以12月的西紅花根際土壤為材料，取樣時(shí)間接近開花期，但土壤中菌群以子囊菌門為主，說明西紅花相同開花時(shí)期，不同栽培地之間菌群在門水平存在顯著差異。研究表明，土壤中菌群群落和相對(duì)豐度受金屬元素[21]、種植方式(間作、連作、輪作)[22-23]、物種[23]、肥料[23]等因素的影響較大。Ambardar等[11-12]證實(shí)了西紅花栽培地土壤中菌群結(jié)構(gòu)受西紅花生長不同時(shí)期、土壤性質(zhì)、栽培模式等因素共同影響。針對(duì)崇明西紅花栽培地水稻-西紅花輪作模式，在11-12月西紅花種植前使用大量基肥，在12月至次年5月進(jìn)行多次追肥的生產(chǎn)模式，進(jìn)一步深入研究西紅花不同生長時(shí)期土壤中菌群的變化，研究肥料類型以及施肥方法對(duì)崇明西紅花栽培地土壤菌群時(shí)空變化，可為西紅花種植前土壤的滅菌、西紅花種球采收后的球莖消毒以及合理施肥提供理論依據(jù)。

西紅花球莖腐爛病是當(dāng)前生產(chǎn)中最常見、危害最嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重影響西紅花的產(chǎn)量和質(zhì)量，其原因主要與土壤中菌群及球莖中內(nèi)生菌有關(guān)[7]。研究表明，土壤中芽孢桿菌屬是引起西紅花球莖腐爛病的主要菌群[12]，而本研究中根際土壤中芽單胞菌屬相對(duì)豐度僅為2.69%，所占比例較少，而在球莖中檢測(cè)到其特有的Saccharopolyspora屬和Pseudonocardia屬菌群，且在種水平上球莖中Cyanobacteria、Streptomyces、Bacillus、Saccharopolyspora和Mitochondria的相對(duì)豐度比根際土壤高10倍以上，這些菌群有可能是導(dǎo)致崇明西紅花球莖腐爛病的因素之一。除了土壤中的菌群，Wani等[9]認(rèn)為西紅花球莖中內(nèi)生菌可能影響其生長、發(fā)芽、適應(yīng)性，以及對(duì)病原體的抗性。因此，本研究開展了西紅花球莖細(xì)菌和真菌的檢測(cè)，結(jié)果顯示，球莖中主要檢測(cè)細(xì)菌和真菌在多樣性明顯低于根際土壤，與根際土壤中微生物在綱、屬和種的組成和相對(duì)豐度均存在明顯差異。此外，球莖中多個(gè)屬和種水平的細(xì)菌和真菌相對(duì)豐度顯著高于根際土壤，甚至部分屬為球莖中特有的屬，如Aspergillus屬雖然在球莖中相對(duì)豐度低于2%，但其僅在球莖中檢測(cè)到，而根際土壤中未檢出。在細(xì)菌和真菌種水平的差異分析中，差異顯著的種基本呈現(xiàn)根際土壤或球莖中所特有，即使部分種在土壤和球莖中均存在，但相對(duì)豐度差異極顯著。

西紅花腐爛病致病菌主要是青霉菌、炭疽菌、絲核菌、曲霉菌和尖孢鐮刀菌等[7]。趙麗娟[24]以有腐爛病癥狀的西紅花球莖為材料，進(jìn)一步分離且證實(shí)了3株真菌為腐爛病主要致病菌，分別為曲霉屬的巴西曲霉、鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌和青霉菌屬的桔青霉菌。2018年，Wani等[25]從西紅花球莖中分離出擔(dān)子菌潛伏病原體(命名為CSE26)，通過植株和田間試驗(yàn)證實(shí)CSE26可導(dǎo)致球莖腐爛，并發(fā)現(xiàn)CSE26產(chǎn)生的氯化芳香族化合物對(duì)擬南芥具有毒性，可能是CSE26致病的原因。Wani等[9]于印度14個(gè)不同西紅花栽培地從休眠期和開花期球莖中分離出294個(gè)內(nèi)生真菌，其中大量存在的為Phialophoramustea、Cadophoramalorum、Talaromycescellulolyticus和Penicilliumgriseofulvum。本研究從球莖真菌中也檢測(cè)到Cadophora屬，且在屬水平相對(duì)豐度為8.68%。Cadophora屬在西紅花研究中尚未見報(bào)道，而該屬真菌大多數(shù)從土壤和植物中分離出，其中Cadophoragregata引起了大豆褐腐病，對(duì)美國大豆產(chǎn)業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)影響[26]；Cadophoramalorum導(dǎo)致獼猴桃枝干的腐爛[27]；從獼猴桃中分離出的Cadophoramelinii和Cadophoraluteoolivacea被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致樹干肥大和縱向樹皮裂縫[28]。而Travadon等[29]認(rèn)為Cadophora是葡萄藤腐爛和變色的主要真菌。因此，西紅花球莖中Cadophora屬真菌，除了Wani等[9]已報(bào)道的Cadophoramalorum外，同屬真菌值得進(jìn)一步分離、鑒定和驗(yàn)證。此外，本研究結(jié)果表明，西紅花球莖中真菌與根際土壤中明顯不同，相對(duì)豐度最高的為Penicillium屬(24.07%)，在種水平則主要為Penicillium_roseopurpureum和Penicillium_steckii，這與Wani等[9,25]的研究結(jié)果一致，即西紅花腐爛病等病害的發(fā)生，除了受土壤中菌群影響以外，可能與西紅花球莖中微生物組成和豐度緊密相關(guān)，且其病害發(fā)生率與其微生物組成和豐度較為相關(guān)。

綜上所述，本研究利用Illumina MiSeq測(cè)序?qū)Τ缑魑骷t花根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行了分析，但不同肥料、施肥方式、施肥量、輪作模式等對(duì)西紅花土壤和球莖不同生長期菌群的影響仍缺乏系統(tǒng)研究，需明確土壤菌群與球莖中菌群的相關(guān)性，針對(duì)西紅花球莖腐爛病的主要細(xì)菌和真菌做進(jìn)一步篩選驗(yàn)證，為西紅花的合理施肥和病害防控提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌存在顯著差異，根際土壤中細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性明顯高于球莖。西紅花根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌在門類水平上菌群類別基本一致，其中除了變形菌門外，根際土壤和球莖中細(xì)菌和真菌門類相對(duì)豐度存在較大差異，在屬和種水平上也存在較大差異。從細(xì)菌和真菌在種水平上差異性分析結(jié)果來看，西紅花病害的發(fā)生可能與球莖中內(nèi)生菌更相關(guān)，尤其是Phialophora和Cadophora。依據(jù)球莖中細(xì)菌和真菌的類別，合理利用殺菌劑開展西紅花種球的消毒，對(duì)于降低西紅花病害的發(fā)生具有重要意義。