王曉瓊，畢秀芳*，謝曉鳳，邢亞閣，李明元

1西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，成都 610039；2宜賓西華大學(xué)研究院，宜賓 644000

近年來我國草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2010年我國草莓的播種面積為11.7萬公頃，產(chǎn)量達(dá)200萬噸[1]。草莓中富含糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有清熱消暑、健脾和胃、潤肺止咳、補(bǔ)益氣血等功效，有“水果皇后”的美稱[2]。但草莓皮薄多汁，貯運(yùn)過程中表皮極易破損而遭受微生物的侵染導(dǎo)致腐爛變質(zhì)，并且草莓收獲時間較為集中，貨架期比較短[3]。目前，草莓最常見的保鮮方法是低溫冷藏、化學(xué)保鮮劑相結(jié)合的處理方法，化學(xué)保鮮劑雖有較好的防腐保鮮效果，但一些化學(xué)保鮮劑長期使用會產(chǎn)生抗藥性致病菌菌株[4]，且很多化學(xué)合成物質(zhì)有污染環(huán)境和危害健康等缺陷，甚至對人體有致畸、致癌、致突變毒性[5]。因此，隨著生活水平的提高，人們趨向于追求廣譜、高效、低(無)毒、無污染的果蔬天然保鮮劑的開發(fā)利用。

伊枯草菌素A是由枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種環(huán)脂肽類化合物，具有抑菌譜廣、抑菌能力強(qiáng)、無毒安全和不易引起耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，是一種極具研究和開發(fā)潛力的生物殺菌劑[6]。同時，Sun等[7]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)口服的抗菌肽對小鼠無急性毒性作用；Dey等[8]對伊枯草菌素A安全性進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)伊枯草菌素A能抑制體內(nèi)腫瘤生長。伊枯草菌素A等脂肽類表面活性劑主要作用于病原菌細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，改變細(xì)胞膜通透性和功能性，從而抑制病原微生物的生長[9]。近幾年，有少量研究利用伊枯草菌素A發(fā)酵液進(jìn)行果蔬采后腐敗控制。Ambrico等[10]研究了BacillussubtilisET-1發(fā)酵上清液對綠霉和青霉的抑制效果，發(fā)現(xiàn)抑菌圈直徑隨著伊枯草菌素A濃度的增加而增加，且伊枯草菌素A可顯著抑制病原菌侵染后檸檬和草莓的病害。Arroyave等[11]發(fā)現(xiàn)9種病原菌對BacillussubtilisEA-CB0015發(fā)酵液表現(xiàn)出不同的敏感性，發(fā)酵液中的伊枯草菌素A和fengycin C對Colletotrichumacutatum和B.cinerea的抑菌效果較好。這些研究為伊枯草菌素A在果蔬采后病害防治中的應(yīng)用提供了一定理論支撐。此外，脂肽類化合物是一種新一代有價值的抗菌藥物，隨著抗菌肽研究的不斷深入和技術(shù)的進(jìn)步，如何將其應(yīng)用于果蔬保鮮已成為研究熱點(diǎn)。本文研究了伊枯草菌素A對草莓腐敗菌的抑制作用，為草莓的病害防治提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

F.fujikuroi由本實(shí)驗(yàn)室保藏，菌種編號為FusariumfujikuroiXHF11312 30.01，分離自四川草莓腐敗果實(shí)表面；B.cinerea購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管中心(China Agricultural Microbial Species Preservation Center，ACCC)，菌種編號為ACCC.37271，菌種斜面均于4 ℃條件下貯藏。

氯化鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；脫氫乙酸鈉(湖北海順達(dá)食品科技有限公司)；納他霉素(浙江一諾生物科技有限公司)；伊枯草菌素A(2.59 mg/mL，中國科學(xué)院成都生物研究所提供)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

HNY-2102C立式智能恒溫培養(yǎng)振蕩器(天津歐諾儀器股份有限公司)；GI54DWS立式自動壓力蒸汽滅菌器(致微(廈門)儀器有限公司)；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；SGSP-02電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)；DS-11A數(shù)顯電導(dǎo)率儀(上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司)；TGL-16冷凍離心機(jī)(湖南湘儀賽德儀器有限公司)；UV-2200紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；BL23光學(xué)顯微鏡(上饒?zhí)觳呷R光儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化與菌懸液的制備

將試管中的F.fujikuroi和B.cinerea于無菌環(huán)境接種至PDA平板上，在28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，培養(yǎng)出灰葡萄孢霉備用。將活化后的菌種用無菌生理鹽水稀釋，制成濃度為106～107CFU/mL的菌懸液。

1.3.2 不同抑菌劑的制備

用無菌水分別配制濃度為1、3、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25、27.5、30 mg/mL的脫氫乙酸鈉和納他霉素溶液，濃度為0.032 4、0.037 0、0.043 2、0.051 8、0.064 8、0.086 3、0.129 5、0.259 mg/mL的伊枯草菌素A溶液，并用0.22 μm微孔過濾膜除菌待用。

1.3.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

抑菌實(shí)驗(yàn)采用濾紙片定量加藥法[10]。將1 mL菌懸液在PDA平板上涂布均勻，再將滅菌后的濾紙片(直徑：6 mm)用無菌鑷子平貼于涂布后的PDA平板上，每個平板放置3～6個紙片，每個紙片上再滴加10 μL抑菌液，且紙片間間距均勻。處理后的平板在28 °C恒溫箱中培養(yǎng)48 h，測定各平板抑菌圈直徑，確定最小抑菌濃度(MIC)。

吸取不同劑量最小抑菌濃度的抑菌劑(100～300 μL)于30 mL PDA培養(yǎng)基混合震搖均勻，再吸取1 mL菌懸液涂布均勻，于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)48 h后觀察是否有菌，以確定三種抑菌劑的最小用量。所有步驟不同時間重復(fù)三次。

1.3.4 抑菌劑處理對腐敗菌細(xì)胞膜通透性的影響及顯微鏡結(jié)構(gòu)變化

吸取最小用量的抑菌劑于20 mL懸浮液中，混勻。再取1 mL加入抑菌劑的菌懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于光學(xué)電子顯微鏡下放大4×10倍觀察菌體形態(tài)，并保存圖像。細(xì)胞膜通透性的測定參考Zhang[11]的方法并稍加修改，將以上懸浮液在10 000 rpm下離心10 min去除菌體，取上清液于紫外分光光度計(jì)260和280 nm處測定吸光值(A260和A280)。由于核酸和蛋白質(zhì)分別在260 nm和280 nm處有最大吸光值，因此在此波長下的吸光值變化可用來估測核酸和蛋白質(zhì)的含量[14]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，并以加無菌水的菌懸液為空白對照。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪圖；采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，顯著水平為0.05，當(dāng)P<0.05時差異顯著，結(jié)果以標(biāo)記字母(a、b、c)表示，不同字母表示有顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抑菌劑對草莓腐敗菌的抑菌效果

2.1.1 三種抑菌劑對兩種草莓腐敗菌的初步抑菌效果判斷

由圖1可知，F(xiàn).fujikuroi在PDA平板上的生長分布密集，少量點(diǎn)狀分布；B.cinerea則為點(diǎn)狀均勻分布于平板上。經(jīng)過三種抑菌劑處理后，兩種草莓腐敗菌平板上每個紙片周圍均有抑菌圈的形成，且肉眼可見，表明脫氫乙酸鈉、納他霉素和伊枯草菌素A三種抑菌劑對F.fujikuroi和B.cinerea的生長均有抑制作用。此外，從圖1中的抑菌圈大小以及抑菌濃度可初步判斷伊枯草菌素A具有較強(qiáng)的抑菌能力，存在較強(qiáng)的優(yōu)勢。

2.1.2 不同濃度的脫氫乙酸鈉的抑菌效果

由圖2可知，3 mg/mL的脫氫乙酸鈉對F.fujikuroi產(chǎn)生明顯的抑菌作用，抑菌圈直徑達(dá)到14.44 mm，隨著濃度的增加，抑菌效果逐漸增強(qiáng)。Li等[15]等研究發(fā)現(xiàn)脫氫乙酸鈉能夠抑制飼料中F.fujikuroi的生長，最低抑菌濃度為80 mg/kg。對于B.cinerea，0～17.5 mg/mL的脫氫乙酸鈉無明顯抑菌作用，提高濃度到20 mg/mL時出現(xiàn)抑菌圈，抑菌直徑為6.84 mm，隨著脫氫乙酸鈉濃度的增加，抑菌作用增強(qiáng)。Wang等[16]研究發(fā)現(xiàn)脫氫乙酸鈉對B.cinerea有較明顯的抑制作用，0.5 mg/mL的脫氫乙酸鈉抑菌率達(dá)到93.2%。脫氫乙酸鈉有廣譜的較強(qiáng)的抗腐敗菌能力，主要通過滲透進(jìn)入微生物的細(xì)胞壁，干擾細(xì)胞內(nèi)各種酶體系而產(chǎn)生抑菌作用[15]。結(jié)果表明脫氫乙酸鈉對F.fujikuroi的抑菌效果比對B.cinerea更好。

圖1 不同抑菌劑對F.fujikuroi與B.cinerea的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different bacteriostatic agents on F.fujikuroi and B.cinerea注：a(5 mg/mL)、b(15 mg/mL)、c(0.051 8 mg/mL)分別為脫氫乙酸鈉、納他霉素和伊枯草菌素A三種抑菌劑處理F.fujikuroi的效果圖，a1(25 mg/mL)、b1(30 mg/mL)、c1(0.037 0 mg/mL)為三種抑菌劑處理B.cinerea的效果圖。Note:The a (5 mg/mL),b (15 mg/mL) and c (0.051 8 mg/mL) were the effects of sodium dehydroacetate,natamycin,and iturin A on F.fujikuroi,respectively.The a1 (25 mg/mL),b1 (30 mg/mL) and c1 (0.037 0 mg/mL) were the effect diagrams of the antibacterial agents for B.cinerea.

2.1.3 不同濃度的納他霉素的抑菌效果

由圖3可知，7.5 mg/mL的納他霉素開始對F.fujikuroi產(chǎn)生明顯的抑菌作用，抑菌圈直徑達(dá)到14.76 mm，且隨著濃度的增加抑菌效果逐漸增強(qiáng)。對B.cinerea，0～17.5 mg/mL的納他素?zé)o明顯抑菌作用，提高濃度到20 mg/mL時出現(xiàn)抑菌圈，抑菌圈直徑為8.21 mm，同時隨著濃度的增加，抑菌作用增強(qiáng)。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)0.25 mg/mL的納他霉素對青霉的抑制直徑為19 mm，可以有效地抑制腐敗菌的生長。納他霉素的作用機(jī)理是通過與細(xì)胞膜里的甾醇，特別是麥角固醇形成復(fù)雜的復(fù)合物，改變細(xì)胞滲透性，從而抑制和殺滅真菌[18]。結(jié)果表明納他霉素對F.fujikuroi的抑菌效果比對B.cinerea更好。

圖2 脫氫乙酸鈉對草莓腐敗菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of sodium dehydroacetate on strawberry spoilage bacteria

圖3 納他霉素對草莓腐敗菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of natamycin on strawberry spoilage bacteria

2.1.4 不同濃度的伊枯草菌素A的抑菌效果

由圖4可知，0.051 8 mg/mL的伊枯草菌素A開始對F.fujikuroi產(chǎn)生明顯的抑菌作用，抑菌圈直徑為8.41 mm。對B.cinerea，0.037 0 mg/mL的伊枯草菌素A產(chǎn)生明顯的抑菌作用，抑菌圈直徑為10.43 mm。隨著伊枯草菌素A濃度的增加，F(xiàn).fujikuroi和B.cinerea的抑菌圈直徑逐漸增大，但是，當(dāng)伊枯草菌素A濃度增加到0.064 8 mg/mL時，隨著濃度的增加，伊枯草菌素A對F.fujikuroi與B.cinerea的抑菌作用趨于平緩，0.064 8～0.259 0 mg/mL之間抑菌圈直徑分別只增加了0.45 mm和0.69 mm。Gu等[19]研究發(fā)現(xiàn)1mg/mL粗伊枯草菌素A溶液在黃瓜灰霉病菌的PDA平皿上可形成1～2 mm的抑菌帶，對灰腐敗菌有一定的抑制效果。Gong[20]研究發(fā)現(xiàn)100 μg/mL 伊枯草菌素A對F.fujikuroi孢子抑制率為100%，50 μg/mL時抑制率為97.51%。伊枯草菌素A對細(xì)胞的破壞是通過在真菌細(xì)胞膜上形成小孔，使離子從小孔中通過使膜的通透性發(fā)生變化實(shí)現(xiàn)抑菌作用[21]。因此，伊枯草菌素A對F.fujikuroi的抑菌效果比對B.cinerea更好。

圖4 伊枯草菌素A對草莓腐敗菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial effect of iturin A on strawberry spoilage bacteria

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三種抑菌劑對兩種草莓腐敗菌均有抑制效果，且隨著濃度的變大，F(xiàn).fujikuroi和B.cinerea的抑菌圈直徑也相應(yīng)增加。當(dāng)三種抑菌劑的濃度較低時，對于兩種菌的抑菌效果較差，可能是由于低濃度中的抑菌劑量少，對于腐敗菌菌落數(shù)的作用數(shù)量有限。而且抑菌紙片的直徑為6 mm，低濃度下產(chǎn)生的抑菌直徑太小(抑菌圈直徑<6 mm)，不能觀察到。隨著抑菌劑濃度的增加，抑菌劑量有效作用的腐敗菌菌落數(shù)量也相應(yīng)增加，抑制效果更好。

2.2 抑菌劑的最小用量

脫氫乙酸鈉、納他霉素和伊枯草菌素A對F.fujikuroi和B.cinerea的最小抑菌濃度和最小用量如表1所示，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知伊枯草菌素A對F.fujikuroi和B.cinerea的MIC分別為0.051 8 mg/mL和0.037 0 mg/mL，遠(yuǎn)低于脫氫乙酸鈉和納他霉素的MIC，同時最小用量均低于300 μL，結(jié)果表明三種抑菌劑的敏感性為伊枯草菌素A>納他霉素>脫氫乙酸鈉。

表1 三種抑菌劑的對F.fujikuroi和B.cinerea的最小抑菌濃度和最小用量Table 1 Minimum inhibitory concentration and minimum dosage of three bacteriostatic agents against F.fujikuroi and B.cinereal

2.3 抑菌劑處理對腐敗菌紫外吸收物質(zhì)滲漏的影響

2.3.1 抑菌劑處理后對腐敗菌核酸滲漏的影響

圖5 抑菌劑處理對腐敗菌核酸滲漏的影響Fig.5 Effect of bacteriostatic treatment on nucleic acid leakage of spoilage bacteria注：圖中大寫、小寫字母分別表示不同抑菌劑對F.fujikuroi和B.cinerea的顯著性差異(P<0.05)，下同。Note:Uppercase and lowercase letters indicated the significant difference of F.fujikuroi and B.cinerea treated by different bacteriostatic agents,respectively (P<0.05),the same below.

細(xì)胞正常代謝必須依靠一個完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞時，胞內(nèi)的一些磷酸鹽、碳酸鹽、DNA與RNA等均會先后從細(xì)胞膜中釋放出來，而這些核內(nèi)物質(zhì)在260 nm處有很強(qiáng)的紫外吸收[22-23]。因此，可以通過檢測菌懸液的紫外吸收來推測菌體細(xì)胞膜完整性的變化。不同抑菌劑處理后兩種草莓腐敗菌內(nèi)核酸物質(zhì)泄露情況如圖5所示，脫氫乙酸鈉、納他霉素和伊枯草菌素A處理后，F(xiàn).fujikuroi內(nèi)的核酸泄漏量均從0.027分別增加至0.241、0.182和0.275，而B.cinerea內(nèi)的核酸泄漏量均從0.036增加至0.459、0.215和0.242。以上結(jié)果說明三種抑菌劑均能破壞細(xì)胞膜，使胞內(nèi)ATP及核酸物質(zhì)泄露而導(dǎo)致吸光值增大，并且不同抑菌劑處理同一腐敗菌，核酸變化差異顯著(P<0.05)。抑菌劑處理后菌懸液中核酸含量增加，可能是由于抑菌劑破壞了腐敗菌細(xì)胞的細(xì)胞壁，使得核酸流入菌懸液[24]。

2.3.2 抑菌劑處理后對腐敗菌蛋白質(zhì)滲漏的影響

不同抑菌劑處理后兩種草莓腐敗菌內(nèi)蛋白質(zhì)泄露情況如圖6所示，脫氫乙酸鈉、納他霉素和伊枯草菌素A處理后，F(xiàn).fujikuroi內(nèi)的蛋白質(zhì)泄漏量均從0.016分別增加至0.155、0.167和0.213，而B.cinerea內(nèi)的蛋白質(zhì)泄漏量均從0.027增加至0.359、0.141和0.211。不同抑菌劑處理同一腐敗菌，蛋白質(zhì)變化差異顯著(P<0.05)。Wang[25]研究發(fā)現(xiàn)2%荊芥原液和2%荊芥提取物溶液處理2.5 min后，腐敗菌的菌懸液胞外蛋白的質(zhì)量濃度大約增加了49 μg/mL和62 μg/mL。抑菌劑處理后菌懸液中蛋白質(zhì)含量增加，可能是由于抑菌劑造成細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的外泄。細(xì)胞膜破損后，細(xì)胞內(nèi)容物外滲，細(xì)胞吸脹受損甚至死亡從而達(dá)到抑菌作用[23]。

圖6 抑菌劑處理對腐敗菌蛋白質(zhì)滲漏的影響Fig.6 Effect of bacteriostatic treatment on protein leakage of spoilage bacteria

由不同抑菌劑處理后腐敗菌懸浮液的紫外吸收物質(zhì)的增加可知，三種抑菌劑均可通過破壞細(xì)胞膜、增大菌體細(xì)胞膜的通透性以及完整性從而使細(xì)胞內(nèi)容物外滲，細(xì)胞吸脹受損甚至死亡，達(dá)到抑菌目的。

2.4 三種抑菌劑處理后草莓腐敗菌的顯微鏡結(jié)構(gòu)變化

圖7 最小抑菌劑用量處理后F.fujikuroi和B.cinerea細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化Fig.7 Changes in cell structure of F.fujikuroi and B.cinerea after treatment with minimal inhibitor注：圖片編號中首位A、B、C、D分別代表脫氫乙酸鈉、納他霉素、伊枯草菌素A和空白對照處理；次位1和2分別代表MIC最小用量和大于最小用量(本次實(shí)驗(yàn)一取400 μL)處理；三位F和B分別表示F.fujikuroi和B.cinerea(4×10倍)。Note:The first digits A,B,C and D in the picture number represented the treatments of sodium dehydroacetate,natamycin,iturin A and the control respectively;The second digits 1 and 2 respectively represented the minimum dosage and greater than the minimum dosage of MIC (400μL) for processing;The three digits F and B represented F.fujikuroi and B.cinerea (4×10 times),respectively.

如圖7所示，三種抑菌劑最低濃度最小用量的處理使F.fujikuroi和B.cinerea原本的菌絲由連貫變得斷裂，破碎成條狀。隨著抑菌劑的增加，菌絲斷裂破碎得更加徹底甚至菌絲破碎成塊狀，而對照組菌絲表面光滑、平整、細(xì)長。目前，其他研究同樣發(fā)現(xiàn)抑菌劑會導(dǎo)致孢子菌絲分離，菌絲斷裂。Zhou等[26]研究發(fā)現(xiàn)12.5 mg/mL的桂枝提取液使青腐敗菌絲畸形，底端及末端腫大，而50 mg/mL的桂枝提取液使青霉病菌菌絲頂端腫大，甚至斷裂，內(nèi)容物外滲，得出高濃度的桂枝提取液對青腐敗菌絲的生長代謝有明顯的抑制作用。因此，抑菌劑通過改變細(xì)胞膜穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，菌絲體斷裂，從而達(dá)到抑菌效果。

3 結(jié)論

以草莓中兩種常見的腐敗菌(F.fujikuroi和B.cinerea)為實(shí)驗(yàn)菌，研究不同濃度的脫氫乙酸鈉、納他霉素、伊枯草菌素A對草莓腐敗菌的抑菌效果。通過三種抑菌劑對F.fujikuroi和B.cinerea的最低抑菌濃度和最小用量分析，得出抑菌敏感性伊枯草菌素A >納他霉素>脫氫乙酸鈉。并通過處理后蛋白核酸泄露實(shí)驗(yàn)證實(shí)了三種抑菌劑均是通過改變細(xì)胞膜通透性，引起胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)流出，達(dá)到抑菌效果。然而，現(xiàn)有研究是草莓的體外抑菌，未來研究可通過草莓保鮮實(shí)驗(yàn)來確定伊枯草菌素A的抑菌效果。