王俊麗，王 龍，歐陽湖，焦松林，任建國

貴州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴陽 550025

太子參為中藥材的一種，有保護心肌功能、促進免疫、抗應激、治療糖尿病、止咳等功效。目前在福建、貴州、江蘇、安徽等地均有種植生產(chǎn)，但由于連作障礙、化肥和農(nóng)藥等過度施用現(xiàn)象的存在，使得藥材品質下降，進而影響到其藥用安全問題。鑒于植物內(nèi)生菌會產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分[1]，且其發(fā)酵不受季節(jié)環(huán)境條件的影響，因而有望代替中藥材的種植生產(chǎn)來獲得藥用活性成分。已有眾多關于藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生活性成分的研究報道，如從銀杏(Ginkgobiloba)葉中分離得到可產(chǎn)生抑菌(Rhizoctoniasolani和Sclerotiniasclerotiorum)物質sporothriolide的內(nèi)生真菌Nodulisporiumsp.A21[2]；從青藤(Sinomeniumacutum)葉中分離得到具有細胞(Hela,HCT116和A549細胞系)毒性活性成分sinopestalotiollides A-D的內(nèi)生真菌Pestalotiopsispalmarum[3]；從藥用植物Polygalaelongata中分離得到具有抗氧化活性(ABTS和DPPH自由基)的內(nèi)生真菌Colletotrichumsp.[4]，另外從藥用植物Azadirachtaindica中分離得到的5株內(nèi)生真菌次生代謝物有機提取物活性表明，其具有抑菌、抗氧化和抗糖尿病功能，因而可用于特定藥物的生產(chǎn)上[5]。Tanapichatsakul等[6]從越南肉桂(Cinnamomumloureiroi)葉中分離得到能產(chǎn)生丁香油酚的內(nèi)生真菌Neopestalotiopsissp.和Diaporthesp.，其代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出明顯的抑菌活性和抗氧化活性。關于太子參內(nèi)生真菌的研究僅有有限報道[7]，為此，本研究計劃從貴州省道地藥材太子參中去分離內(nèi)生真菌，以研究其代謝產(chǎn)物抗氧化活性，為天然活性化合物的獲得奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：新鮮太子參(Pseudostellariaheterophylla)塊根(來自貴州省施秉縣牛大場鎮(zhèn)太子參種植基地)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Sigma公司)；福林酚試劑(上海荔達生物科技有限公司)；沒食子酸(中國藥品生物制品鑒定所)；抗壞血酸(中國藥品生物制品鑒定所)；其它化學試劑均為分析純。

儀器：Multiskan GO酶標儀(賽默飛世爾科技)；FA1004N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；GL-21B離心機(上海安亭科學儀器廠)；R-100旋轉蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司)；CLG-32L全自動高壓滅菌器(日本ALP)；SW-CJ-1B超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)；ZGP-9050P隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海喆圖科學儀器有限公司)；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)用于分離、活化真菌，馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)用于菌株發(fā)酵。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化

把采集來的新鮮無病斑太子參塊根樣品用自來水清洗干凈、風干，然后依次用75%的酒精表面消毒1 min、5%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，再用無菌水清洗5次，取100 μL的第5次清洗液放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板中，進行涂布培養(yǎng)(30 ℃)，以確證表面徹底消毒。

在超凈工作臺上把經(jīng)表面消毒的太子參塊根切成約1 cm見方的組織塊，放入PDA平板中，每個平板等間距放置3個組織塊，于30 ℃下恒溫培養(yǎng)以分離內(nèi)生真菌。通過不定期觀察，將從塊根上已經(jīng)分離出的菌絲體移接于其它PDA平板上，恒溫培養(yǎng)(30 ℃)且觀察真菌是否純化。純化菌株移接PDA試管培養(yǎng)、低溫保存和備用。

1.2.2 內(nèi)生真菌的致病性測定

將分離得到的內(nèi)生真菌進行致病性測定：首先對新鮮無病斑太子參塊根進行表面消毒(采用實驗“1.2.1”中的消毒方法)，然后用解剖刀橫切塊根約為相等兩份，分別置于用無菌水浸潤的滅菌濾紙(位于培養(yǎng)皿內(nèi))上，在其中的一份塊根組織切口處接種內(nèi)生真菌，另一份不接種作為對照，用封口膜密封培養(yǎng)皿，28 ℃下恒溫培養(yǎng)，觀察塊根切口致病情況。若組織切口有變褐、軟化，且菌絲體大量生長，初步判斷為該內(nèi)生真菌為病原真菌。該菌株再經(jīng)柯赫氏法則驗證后，即為病原真菌，否則為內(nèi)生真菌。

1.2.3 內(nèi)生真菌的鑒定

致病性內(nèi)生真菌的初步鑒定依照PDA平板培養(yǎng)特征、產(chǎn)孢結構及孢子的顯微觀察進行；而非致病性內(nèi)生真菌的鑒定步驟如下：從PDA平板上挑取少量菌絲體移入已滅菌的盛50 mL 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)三角瓶中，28 ℃、120 rpm水浴振蕩搖床培養(yǎng)7天，用滅菌玻璃棒挑取菌絲團進行DNA提取。具體提取過程參考真菌DNA提取試劑盒說明書(Qiagen 69104 DNeasy Plant Mini Kit(50)，德國QIAGEN公司)。采用引物ITS1和ITS4擴增內(nèi)生真菌菌株的rDNA ITS區(qū)，進行PCR 反應。反應條件：93 ℃預變性3 min，94 ℃預變性4 min，95 ℃變性0.5 min，55 ℃復性1.0 min，72 ℃延伸0.5 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。測序所得的序列，利用BLAST與GenBank中的已知序列進行比對，尋找相似度最高的菌株，結合形態(tài)學特征，確定內(nèi)生真菌的分類地位。

1.2.4 內(nèi)生真菌抗氧化活性試驗

將內(nèi)生真菌在PDA平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取6 mm菌碟接種于150 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中培養(yǎng)，29 ℃、180 rpm培養(yǎng)5天，以不接種內(nèi)生真菌的培養(yǎng)液作為空白對照，重復3次。依照Pan等[8]方法進行石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物制備和6個不同濃度各提取物供試液制備(見表1)。DPPH自由基清除能力測定參考余蘭彬等方法[9]；羥自由基(·OH)清除能力測定參考任薇等方法[10]；以1 mmol/L抗壞血酸為陽性對照。

表1 不同極性供試液濃度設置Table 1 Concentration setting of the different polar solutions assayed (mg/mL)

1.2.5 內(nèi)生真菌抗氧化成分分析

多酚含量測定采用福林酚法[11]。標準曲線繪制：用蒸餾水配制濃度為0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL沒食子酸溶液，分別取上述溶液1 mL于25 mL試管中，再加1.0 mL福林酚試劑、23.0 mL 5%碳酸鈉溶液，混勻后于25 ℃水浴60 min，在745 nm下測定吸光度，繪制標準曲線為y=47.786x+0.104 3(R2=0.972 7)。

樣品含量測定：取5 μL樣品溶液于EP管，加5 μL福林酚試劑、240 μL 5%碳酸鈉溶液，混勻，恒溫水浴后在745 nm測定吸光度。每個樣品重復三次?？偡雍恳悦亢辽囵B(yǎng)液含有相當沒食子酸的毫克數(shù)表示，即mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以上試驗數(shù)據(jù)均重復測定3次，其結果以平均數(shù)的形式表示。采用SPSS17.0(IBM公司)統(tǒng)計分析軟件。檢驗水準α=0.05。Excel進行數(shù)據(jù)整理。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的獲得

經(jīng)純化分離獲得10株內(nèi)生真菌，PDA平板培養(yǎng)特征見圖1。由PDA平板培養(yǎng)特征結合菌絲體生長情況，將內(nèi)生真菌分為3類：第1類包括菌株GS-1、GS-3、GS-5、MD-2、MD-3、MD-5和MD-6，菌絲體呈現(xiàn)棉絮狀，有紫色色素產(chǎn)生。菌絲體生長速度快，28℃恒溫培養(yǎng)5天，菌落直徑達9 cm；第2類為GS-7和GS-8，菌絲體致密、平鋪呈墊狀，有黃黑色色素產(chǎn)生。菌絲體生長速度慢，28 ℃恒溫培養(yǎng)7天，菌落直徑約5 cm；第3類為菌株NSZJ-1，白色菌絲體致密、平鋪于培養(yǎng)基表面，背面有棕褐色色素產(chǎn)生。菌絲體生長速度慢，28 ℃恒溫培養(yǎng)7天，菌落直徑約3～4 cm之間(圖1-1)。由此可見,太子參塊根含有豐富的內(nèi)生真菌資源。

圖1 內(nèi)生真菌在PDA平板上的培養(yǎng)特征Fig.1 The cultural characteristics of endophytic fungi on PDA plate注：1～10：NSZJ-1、GS-1、GS-3、GS-5、GS-7、GS-8、MD-2、MD-3、MD-5、MD-6。

2.2 內(nèi)生真菌的致病性

室內(nèi)新鮮太子參塊根接種致病情況表明，菌株NSZJ-1為非致病內(nèi)生真菌(塊根組織不呈現(xiàn)軟化變褐現(xiàn)象)，而菌株GS-1、GS-3、GS-5、GS-7、GS-8、MD-2、MD-3、MD-5和MD-6均為致病內(nèi)生真菌(塊根組織呈現(xiàn)軟化變褐現(xiàn)象)，其感染致病太子參塊根狀況見圖2。受致病內(nèi)生真菌感染的塊根出現(xiàn)腐爛壞死狀，且菌絲體在塊根上生長旺盛(圖2-4)，而非致病內(nèi)生真菌接種后的塊根則無上述變化(圖2-2)。由此可見，外觀呈現(xiàn)無感病狀態(tài)的太子參塊根其內(nèi)部潛伏存在有病原真菌的侵染。

圖2 內(nèi)生真菌對太子參塊根致病情況測試Fig.2 Assays on pathogenicity of endophytic fungi on root tuber of Pseudostellaria heterophylla注：1和3為對照；2和4為接種內(nèi)生真菌。Note:1 and 3 are controls;2 and 4 are inoculated with endophytic fungi.

2.3 內(nèi)生真菌的鑒定

由試驗結果“2.1”得到的第1類內(nèi)生真菌產(chǎn)孢結構為單瓶梗，有大型鐮刀狀分生孢子和小型分生孢子，且有紫色素產(chǎn)生，初步確定為鐮刀菌類(Fusariumsp.)；第2類內(nèi)生真菌產(chǎn)孢結構輪枝分支，有球形分生孢子，且有黑色素產(chǎn)生，初步鑒定為輪枝孢菌類(Verticilliumsp.)；第3類內(nèi)生真菌NSZJ-1產(chǎn)孢結構為單瓶梗或輪枝分支，有大型柱狀分生孢子(多為3分隔，平直)和厚垣孢子形成(圖3)。ITS序列分析表明其與Cylindrocarponsp.(AB369260.1)、Dactylonectriapauciseptata(LC427841.1)、Cylindrocarponpauciseptata(JF735305.1)和Ilyonectriaradicicola(HM214452.1)有100%同源性(系統(tǒng)進化樹自展值為99%，見圖4)，結合菌株NSZJ-1在PDA上的培養(yǎng)特征以及大型分生孢子的隔膜數(shù)、小型分生孢子和厚垣孢子的有無以及參考文獻[12]，將內(nèi)生菌NSZJ-1鑒定為柱孢屬(Cylindrocarponsp.)。

圖3 內(nèi)生菌NSZJ-1菌絲體及孢子形態(tài)顯微結構(×10)Fig.3 Microscopic structures of mycelia and spores of endophytic fungus NSZJ-1 (×10)

圖4 基于 rDNA ITS序列系統(tǒng)進化樹的構建(鄰接法)Fig.4 The construction of phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence (neighbour joining method)

2.4 內(nèi)生真菌NSZJ-1的抗氧化活性

內(nèi)生真菌振蕩培養(yǎng)、去除菌體后，不同極性粗提物DPPH自由基清除能力和羥自由基(·OH)清除能力測定結果見圖5和6。從圖5和6中可看出，在各相粗提物測試濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，DPPH自由基和羥自由基(·OH)清除率增加。石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物清除DPPH自由基、羥自由基(·OH)的IC50值分別為270.537、27.189、2.061、0.672、6.181 mg/mL和946.221、39.957、9.466、1.053和11.270 mg/mL，由此可見，內(nèi)生真菌抗氧化物質主要集中在乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物中，且正丁醇提取物抗氧化性最強，其次為乙酸乙酯提取物。1 mmol/L 抗壞血酸的DPPH自由基和羥自由基(·OH)清除率分別為96%和95.1%。

2.5 內(nèi)生真菌NSZJ-1抗氧化成分多酚測定

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物總多酚含量用沒食子酸當量(mg/mL)來表示，分別為0.000 1、0.002 9、0.005 5、0.018 6、0.011 1 mg/mL。內(nèi)生真菌NSZJ-1多酚主要集中在正丁醇提取物中，其次為乙醇提取物中，再者為乙酸乙酯提取物，而在二氯甲烷提取物中多酚的含量約為前三者的15%～50%，石油醚提取物中多酚含量幾乎為0；二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物中多酚含量與DPPH自由基和羥自由基清除率的關系分別見圖7和8。

圖5 不同極性有機提取物對DPPH清除能力Fig.5 The scavenging capacities of different polar extracts on DPPH radical

圖6 不同極性有機提取物對羥自由基清除能力Fig.6 The scavenging capacities of different polar extracts on hydroxyl radical

在一定范圍內(nèi)，多酚對DPPH自由基和羥自由基的清除率隨其濃度的增加而增強。二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇提取物中多酚清除DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.966、0.949、4.138、1.677 μg/mL和3.353、4.415、6.241、2.710 μg/mL。

圖7 不同有機提取物中多酚含量與DPPH自由基清除率的關系Fig.7 Relationship between the contents of polyphenols in different organic phase extracts and DPPH radical scavenging efficiency注：A：二氯甲烷；B：乙酸乙酯；C：正丁醇；D：乙醇。Note:A:Dichloromethane;B:Ethyl acetate;C:n-Butanol;D:Ethanol.

圖8 不同有機提取物中多酚含量與羥自由基清除率的關系Fig.8 Relationship between the contents of polyphenols in different organic phase extracts and hydroxyl radical scavenging efficiency

3 討論

目前已從藥用植物中獲得具有抗細菌、真菌、病毒、氧化、腫瘤、糖尿病和利什曼病等作用的眾多內(nèi)生真菌，因而有望被用于臨床藥物開發(fā)研究中。本研究從貴州道地藥材基地采取太子參分離獲得的內(nèi)生真菌NSZJ-1為柱孢屬(Cylindrocarponsp.)明顯不同于福建產(chǎn)地太子參分離得到的內(nèi)生真菌(DPPH自由基清除的IC50值相差很大)[7]，進而說明宿主植物棲息地點對內(nèi)生真菌的寄主專一性有影響[13]。

對于藥用植物內(nèi)生真菌代謝物抗氧化研究方面，前人已有諸多報道。Septiana等[14]從Curcumalonga葉中分離得到的內(nèi)生真菌Bo.Ci.Cl.D1和Bo.Ci.Cl.D2，其乙酸乙酯提取物對DPPH自由基清除的IC50值分別為24.04和96.08 mg/mL，多酚含量分別為113.47和81.83 mg/g，該結果表明提取物多酚含量與其清除DPPH自由基能力正相關，同時也間接暗示了這類物質是主要的抗氧化劑。關于藥用植物內(nèi)生真菌抗氧化研究，以往大多研究集中在乙酸乙酯提取物方面[15,16]，且發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的抗氧化能力與其代謝物全酚含量正相關[15]。Sorout和Arunachalam[17]從藥用植物Azadirachtaindica中分離得到5株內(nèi)生真菌，不同內(nèi)生真菌含有的植物化學成分種類各不相同，其中F5菌株代謝物植物化學成分種類最多，對其進行PDB發(fā)酵培養(yǎng)、有機溶劑提取得到的石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯提取物進行全酚測定及抗氧化(DPPH自由基清除)試驗，結果表明：多酚含量為乙酸乙酯提取物>二氯甲烷提取物>石油醚提取物；抗氧化活性為乙酸乙酯提取物>二氯甲烷提取物>石油醚提取物。本研究采用與文獻[17]相同的培養(yǎng)基質進行內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)，獲得了與其相似的抗氧化活性結果，具體表現(xiàn)在各提取物的IC50值上。Xue等[18]對內(nèi)生真菌代謝物的抗氧化性(DPPH自由基和羥自由基)研究表明，3個內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物有較強的DPPH自由基清除能力，但對羥自由基的清除能力卻很弱，本研究結果表明內(nèi)生真菌NSZJ-1的正丁醇提取物有明顯的DPPH自由基、羥自由基清除能力，但進一步試驗表明乙酸乙酯提取物中多酚具有較強的DPPH自由基清除能力，乙醇提取物中的多酚具有較強的羥自由基清除能力，造成有機溶劑粗提物與多酚類物質對自由基清除結果不一致的原因可能是內(nèi)生真菌還可能產(chǎn)生多酚類之外的其它類抗氧化物質。

目前除了本研究從太子參塊根中分離得到柱孢屬(Cylindrocarponsp.)內(nèi)生真菌外，也有文獻報道從藥用植物Parispolyphyllavar.yunnanensis[19]、Sapiumellipticum[20]和Saussureainvolucrate[21]等中分離得到此屬內(nèi)生真菌，且相關文獻報道此屬內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生一些新結構化合物[20]，為此今后有必要對太子參內(nèi)生真菌NSZJ-1代謝物進行單體分離、純化、結構鑒定及其生物活性開展研究，為天然藥物開發(fā)利用奠定基礎。