祝友朋，韓長志

西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院/云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室， 昆明 650224

微生物中次生代謝產(chǎn)物的種類是由次生代謝合成基因簇決定的，次生代謝產(chǎn)物一般具有抗菌、免疫抑制、產(chǎn)生毒素、降低致病性等多種生物活性[1]，其作為人類疾病藥劑及農(nóng)林業(yè)植物病蟲害藥劑開發(fā)的重要來源，在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。目前，國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于真菌次生代謝產(chǎn)物合成基因簇的研究主要集中在次生代謝產(chǎn)物挖掘[2]、次生代謝產(chǎn)物合成基因的篩選鑒定及其克隆[3]、聚酮合酶[4-5]和非核糖體肽合成酶[6-7]的作用等方面。關(guān)于細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物合成基因簇的研究主要是利用antiSMASH數(shù)據(jù)庫(antibiotics & secondary metabolite analysis shell)對635個細(xì)菌的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)40種基因簇中非核糖體肽合成酶(NRPS)、Ⅰ型聚酮合酶(T1PKS)、細(xì)菌素(bacteriocin)、萜烯(terpene)等4種基因簇在所有的細(xì)菌門中都存在，其他的基因簇存在于某個門或2個及以上的門中[8]。植物病原絲狀真菌作為侵染植物的重要微生物之一，其具有的分泌蛋白、碳水化合物活性酶以及次生代謝產(chǎn)物在損害植物免疫防衛(wèi)反應(yīng)系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要的作用[9]。前期筆者所在研究室開展了關(guān)于植物病原絲狀真菌及細(xì)菌分泌蛋白、CAZymes預(yù)測及功能解析工作[10]，然而，關(guān)于不同營養(yǎng)類型真菌中次級代謝產(chǎn)物合成基因簇及不同營養(yǎng)類型真菌與次生代謝產(chǎn)物合成基因簇之間的關(guān)系尚不明確。

antiSMASH數(shù)據(jù)庫中關(guān)于微生物的次生代謝合成基因簇的種類共有59種，主要有聚酮合酶(PKS)、terpene和NRPS等[11]。其中，PKS能合成聚酮類化合物，主要有T1PKS、T2PKS和T3PKS，可用于研制抗生素、抗菌劑等；terpene是萜類化合物的總稱，具有重要的生物活性，是進(jìn)行產(chǎn)物研究和新藥開發(fā)的重要來源；NRPS能合成非核糖體肽(non-ribosomal peptides,NRP)，在真菌的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，該蛋白在真菌致病過程中扮演著重要角色，由多個催化結(jié)構(gòu)域組成的高度模塊化的肽合成酶，包括腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(A結(jié)構(gòu)域)、巰基化結(jié)構(gòu)域(T結(jié)構(gòu)域)和縮合結(jié)構(gòu)域(C結(jié)構(gòu)域)等[12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，由蘋果斑點落葉病(Altenariaalternata)產(chǎn)生的AM-毒素[13]、玉米圓斑病菌(Cochlioboluscarbonum)產(chǎn)生的HC-毒素[14]以及玉米小斑病菌(Cochliobolusheterostrophus)[15]、水稻胡麻斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)[16]、擬南芥黑斑病菌(Alternariabrassicicola)[16]、柑橘褐斑病菌(Alternariaalternata)和禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中的NPS6基因[17]以及蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)的NPS12基因均與上述病原真菌的致病性有關(guān)[18]，在實現(xiàn)NRP合成及在真菌生長發(fā)育、信號傳導(dǎo)及致病等過程中都發(fā)揮著重要的作用[19]。然而，不同營養(yǎng)類型植物病原真菌與不同類型次生代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系尚不清楚。

本研究選擇不同營養(yǎng)類型植物病原真菌開展次生代謝產(chǎn)物合成基因簇的注釋工作，利用antiSMASH數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋分析，對比分析17種具有不同營養(yǎng)類型的植物病原菌和5種腐生營養(yǎng)型真菌的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，以期發(fā)現(xiàn)次生代謝產(chǎn)物合成基因簇與不同營養(yǎng)類型植物病原真菌之間的關(guān)系，為今后深入研究不同營養(yǎng)類型植物病原菌中次生代謝產(chǎn)物的作用機(jī)制及找尋新型藥劑作用靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

選擇植物病原真菌(活體營養(yǎng)型、半活體營養(yǎng)型以及死體營養(yǎng)型)、腐生營養(yǎng)型真菌等22種真菌開展次生代謝產(chǎn)物預(yù)測分析。包括4種活體營養(yǎng)型真菌：玉米黑粉病菌(Ustilagomaydis)、玉米絲黑穗病菌(Sporisoriumreilianum)、小麥稈銹病菌(Pucciniagraminis)、戈洛文白粉菌(Golovinomycesmagnicellulatus)；6種半活體營養(yǎng)型真菌：小麥葉枯病菌(Zymoseptoriatritici)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)、禾谷炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)、希金斯炭疽菌(C.higginsianum)、西瓜炭疽菌(C.orbiculare)和假禾谷鐮刀菌(Fusariumpseudograminearum)；7種死體營養(yǎng)型真菌：玉蜀黍雙極蠕孢(Bipolarismaydis)、小麥葉斑病菌(Parastagonosporanodorum)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、苜蓿輪枝菌(Verticilliumalfalfae)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、葡萄孢菌(Botrytiscinerea)；5種腐生營養(yǎng)型真菌：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。

1.2 不同真菌次生代謝產(chǎn)物合成基因簇差異分析

利用antiSMASH[11](https://fungismash.secondarymetabolites.org/#!/start)注釋不同營養(yǎng)類型真菌的PKS、NRPS和TPS等基因簇。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及Origin 9.0作圖軟件對所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同營養(yǎng)類型真菌中次生代謝產(chǎn)物合成基因簇種類對比分析

對22種真菌開展次生代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個腐生營養(yǎng)型真菌的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇的種類和數(shù)量差異較大，其中釀酒酵母僅有3個次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，分別是NRPS-like、terpene和含β-內(nèi)酯的蛋白酶抑制劑(betalactone)；黑曲霉具有12種共63個次生代謝產(chǎn)物合成基因簇(圖1)。同時，在植物病原真菌中，半活體營養(yǎng)型真菌和死體營養(yǎng)型真菌的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇的種類和數(shù)量都高于活體營養(yǎng)型真菌(圖1)：半活體營養(yǎng)類型真菌中次生代謝產(chǎn)物合成基因簇種類有11～18種，數(shù)量34～76個；死體營養(yǎng)類型真菌中次生代謝產(chǎn)物合成基因簇種類有6～11種，數(shù)量20～51個；活體營養(yǎng)類型真菌中次生代謝產(chǎn)物合成基因簇種類有4～5種，數(shù)量6～19個。在半活體營養(yǎng)類型真菌中，次生代謝產(chǎn)物合成基因簇種類和數(shù)量最多的是希金斯炭疽菌；在死體營養(yǎng)類型真菌中，次生代謝產(chǎn)物合成基因簇種類最多的是尖孢鐮刀菌，數(shù)量最多的是玉蜀黍雙極蠕孢；在活體營養(yǎng)類型真菌中，次生代謝產(chǎn)物合成基因簇種類和數(shù)量最多的是戈洛文白粉菌。

2.2 不同類別次生代謝產(chǎn)物合成基因簇數(shù)量對比分析

進(jìn)一步對不同營養(yǎng)類型真菌中次生代謝產(chǎn)物合成基因簇的數(shù)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：22種真菌中編碼次生代謝產(chǎn)物的基因簇類型有單一型和復(fù)合型，前者有10種，后者有26種(圖2)。其中，單一型基因簇存在較多的是T1PKS、terpene、NRPS和NRPS-like等，在植物病原菌和腐生真菌中都存在(圖2A)。對不同營養(yǎng)類型植物病原菌進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，活體營養(yǎng)型植物病原菌中僅存在T1PKS、terpene、NRPS和NRPS-like基因簇，半活體營養(yǎng)型植物病原菌中存在的單一基因簇種類最多，其獨特存在betalactone、依賴tRNA的環(huán)二肽合成酶(CDPS)、鐵載體(siderophore)和Ⅲ型聚酮合酶(T3PKS)等基因簇(圖2B)。復(fù)合型基因簇存在較多的是NRPS+T1PKS、T1PKS+NRPS、吲哚(indole)+T1PKS、T1PKS+indole、NRPS-like+T1PKS和T1PKS+NRPS-like，在半活體營養(yǎng)型、死體營養(yǎng)型病原菌和腐生真菌中存在(圖2C)。

圖1 不同營養(yǎng)類型真菌次生代謝產(chǎn)物合成基因簇的種類(A)和數(shù)量(B)對比分析

A,B：單一次生代謝產(chǎn)物合成基因簇分布情況；C,D：復(fù)合次生代謝產(chǎn)物合成基因簇分布情況。A,B：Distribution of single primary metabolite synthesis gene cluster; C,D：Compound secondary metabolite synthesis gene cluster distribution.

此外，半活體營養(yǎng)型病原菌中存在9種獨特的復(fù)合型基因簇，分別是NRPS-like+terpene、NRPS+NRPS-like、NRPS+fungal-RiPP、NRPS+betalactone、NRPS-like+betalactone、betalactone+NRPS-like、indole+terpene、具有POP或UstH肽酶類型和修飾的真菌RiPP(fungal-RiPP)+terpene和NRPS+T1PKS+fungal-RiPP；死體營養(yǎng)型病原菌中存在6種獨特的復(fù)合型基因簇，分別是NRPS+terpene、NRPS-like+NRPS、indole+NRPS+T1PKS、T3PKS+T1PKS、terpene+T1PKS+NRPS和T1PKS+NRPS-like+other；腐生真菌存在2種獨特的復(fù)合型基因簇，分別是T1PKS+NRPS+indole和NRPS+NRPS-like+indole(圖2D)。

2.3 不同營養(yǎng)類型植物病原菌中NRPS預(yù)測分析

對17個植物病原真菌的次生代謝產(chǎn)物NRPS合成基因簇開展分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半活體營養(yǎng)類型真菌中NRPS基因簇5～11個，NRPS基因數(shù)為7～20個；死體營養(yǎng)類型真菌中NRPS基因簇數(shù)量3～9個，NRPS基因數(shù)量2～14個；活體營養(yǎng)類型真菌中NRPS基因簇數(shù)量1～3個，NRPS基因數(shù)量1～8個(圖3)。上述結(jié)果表明，半活體和死體營養(yǎng)型病原菌中NRPS基因簇數(shù)量及NRPS基因數(shù)量均高于活體營養(yǎng)型病原菌。

2.4 不同營養(yǎng)類型植物病原菌中PKS預(yù)測分析

對17個植物病原真菌的次生代謝產(chǎn)物PKS合成基因簇開展分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半活體營養(yǎng)類型真菌中PKS基因簇數(shù)量有5～27個，PKS基因數(shù)量6～48個，但T3PKS基因簇尚未預(yù)測出其基因組成情況；死體營養(yǎng)類型真菌中PKS基因簇數(shù)量7～20個，PKS基因數(shù)量7～40個；活體營養(yǎng)類型真菌中PKS基因簇數(shù)量0～1個，PKS基因數(shù)量0～2個(圖4)。上述結(jié)果表明，半活體和死體營養(yǎng)型病原菌中PKS基因簇數(shù)量及PKS基因數(shù)量均高于活體營養(yǎng)型病原菌。

2.5 不同營養(yǎng)類型植物病原菌中萜烯預(yù)測分析

對17個植物病原真菌的次生代謝產(chǎn)物萜烯合成基因簇開展分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半活體營養(yǎng)類型真菌中萜烯基因簇數(shù)量3～12個，死體營養(yǎng)類型真菌中萜烯基因簇數(shù)量2～13個，活體營養(yǎng)類型真菌中PKS基因簇數(shù)量2～4個(圖5)。上述結(jié)果表明，半活體和死體營養(yǎng)型病原菌中萜烯基因簇數(shù)量均高于活體營養(yǎng)型病原菌。

A:NRPS基因簇的數(shù)量； B:NRPS基因的數(shù)量。A：The number of NRPS gene cluster; B：The number of NRPS genes.

A:PKS基因簇的數(shù)量； B:PKS基因的數(shù)量。A：The number of PKS gene clusters; B：The number of PKS genes.

圖5 不同營養(yǎng)類型植物病原菌中所含有萜烯基因簇的數(shù)量對比情況

3 討 論

對植物次生代謝基因簇的研究發(fā)現(xiàn)其參與合成苯并噁唑嗪酮、生氰糖苷、生物堿和萜烯等化合物，與植物的生長發(fā)育有關(guān)，并參與植物的防御反應(yīng)[20]。前人對病原菌次生代謝產(chǎn)物基因的研究集中在NRPS基因和PKS基因，發(fā)現(xiàn)玉米小斑病菌[15]、水稻胡麻斑病菌[16]、擬南芥黑斑病菌[16]、柑橘褐斑病菌和禾谷鐮刀菌中的NPS6基因[17]以及蘋果樹腐爛病菌NPS12基因均與致病性有關(guān)[18]；漸綠木霉[21]、黃曲霉[22]、大麗輪枝菌[23]和球孢白僵菌[5]的PKS基因與生長發(fā)育和侵染性有關(guān)。在植物與病原菌互作及病原菌損害植物的免疫防衛(wèi)反應(yīng)系統(tǒng)方面也有許多學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究。如趙中濤[24]通過比較基因組的方法對94個真菌的糖類活性酶進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)植物病原菌中半活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌中糖類活性酶的種類和數(shù)量均高于活體營養(yǎng)型真菌；陳相永等[25]通過植物病原真菌寄生性與分泌蛋白組及CAZymes的比較分析，發(fā)現(xiàn)半活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌分泌蛋白占全基因組序列的比例高于活體營養(yǎng)型真菌，半活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌的糖基水解酶家族GH和多糖裂解酶家族PL的數(shù)量均高于活體營養(yǎng)型真菌，且半活體營養(yǎng)型和死體營養(yǎng)型真菌參與植物細(xì)胞壁纖維素、木聚糖、果膠等成分降解的基因也高于活體營養(yǎng)型真菌。

本研究發(fā)現(xiàn)半活體和死體營養(yǎng)型病原菌次生代謝產(chǎn)物合成基因簇存在復(fù)合基因簇，而活體營養(yǎng)型病原菌中僅存在單一基因簇，但核盤菌在油菜上的營養(yǎng)類型是死體營養(yǎng)型，而在小麥上營養(yǎng)類型則是活體營養(yǎng)型[26]，由于寄主植物不同而引起其次生代謝產(chǎn)物合成基因簇是否存在差異性尚不清楚，有待進(jìn)一步確認(rèn)。此外，T3PKS基因簇僅存在于半活體和死體營養(yǎng)型病原菌中，但未發(fā)現(xiàn)該基因簇的基因組成情況，其復(fù)合基因簇和T3PKS基因簇是否與非活體寄生有關(guān)有待進(jìn)一步驗證。同時，本研究對不同營養(yǎng)類型真菌的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇進(jìn)行對比分析，比較了NRPS基因簇、PKS基因簇和萜烯基因簇在不同營養(yǎng)類型真菌中的分布。然而，對于植物病原真菌中的次生代謝產(chǎn)物研究特別是對于編碼基因的功能尚不清楚，嚴(yán)重制約著人們對次生代謝產(chǎn)物在植物病原真菌侵染植物后所發(fā)揮的作用的認(rèn)知，有待于今后開展相關(guān)生物學(xué)試驗研究。