朱強(qiáng)勝，何珊，梁旭方，陳珂，鄒家明

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚(yú)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部鱖魚(yú)育種創(chuàng)新基地/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430070

翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)，隸屬鱸形目(Perciformes)、真鱸科(Percichthyidae)，是我國(guó)特有的淡水魚(yú)珍品。其食性奇特，終生以活魚(yú)蝦為食，在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化后才可接受人工飼料[1]。而近年來(lái)由于餌料魚(yú)供應(yīng)困難，翹嘴鱖人工飼料的研究就顯得尤為重要[2]。組氨酸已經(jīng)被證實(shí)是維持水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體生命活動(dòng)的必需氨基酸，由于機(jī)體自身不能夠合成，必須通過(guò)攝食獲取[3]。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，組氨酸過(guò)量或不足可顯著降低動(dòng)物的食物攝入量，這種抑制作用可能是通過(guò)激活組胺神經(jīng)元來(lái)實(shí)現(xiàn)的[4]，而在魚(yú)類(lèi)中，關(guān)于組氨酸的研究主要集中在其營(yíng)養(yǎng)需求量的確定上[5-7]，對(duì)于組氨酸影響魚(yú)類(lèi)攝食調(diào)控機(jī)制還知之甚少。此外，動(dòng)物機(jī)體在感應(yīng)氨基酸過(guò)程中涉及兩個(gè)重要信號(hào)通路，即哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammals target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路和一般氨基酸調(diào)控阻遏蛋白2(general amino acid control non-derepressible 2,GCN2)信號(hào)通路[8]，這兩個(gè)信號(hào)通路可能參與動(dòng)物的攝食調(diào)控[8-9]，也有研究進(jìn)一步表明下丘腦中的mTOR信號(hào)與能量攝入的調(diào)節(jié)直接相關(guān)[10]。筆者在前人研究[11-12]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討組氨酸對(duì)翹嘴鱖攝食調(diào)控的影響，以期完善必需氨基酸對(duì)翹嘴鱖攝食調(diào)控的機(jī)制研究，并為翹嘴鱖人工飼料的開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1)試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)用翹嘴鱖(38～42 g)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚(yú)研究中心提供。試驗(yàn)開(kāi)始前先將翹嘴鱖轉(zhuǎn)移到循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)暫養(yǎng)1周，單缸單尾，每缸(40 cm×50 cm×40 cm)放置1尾翹嘴鱖，水溫維持在(24±1) ℃，保持12 h光照與12 h黑暗交替循環(huán)周期，pH 7.0～7.5，溶氧為7.5～8.5 mg/L，每天08:00和18:00用(0.35±0.05) g麥瑞加拉鯪飽食投喂。

2)主要試劑。L-組氨酸(晶體氨基酸)、組胺(美國(guó)Sigma公司)；10 μL不銹鋼微量注射器(上海高鴿公司)； L-15培養(yǎng)液(Genom生物公司)；胎牛血清 (fatal bovine serun,FBS)、含0.25% EDTA的胰蛋白酶、I型膠原酶(Gibco公司)；DPBS、兩性霉素B、硫酸慶大霉素、青鏈霉素雙抗(HyClone公司)。

1.2 分組及處理

1)活體處理。翹嘴鱖暫養(yǎng)結(jié)束后挑選規(guī)格均一的個(gè)體隨機(jī)分成3組，每組設(shè)10個(gè)平行，每缸(40 cm×50 cm×40 cm)放置1尾翹嘴鱖。在正式試驗(yàn)開(kāi)始前，將試驗(yàn)用魚(yú)進(jìn)行24 h饑餓處理。試驗(yàn)時(shí)用MS-222將翹嘴鱖麻醉，稱(chēng)質(zhì)量，然后用10 μL量程的微量注射器于腦室注射藥品，注射劑量的選擇參照文獻(xiàn)[12-13]，對(duì)照組注射4 μL的磷酸鹽緩沖液(PBS)，2個(gè)試驗(yàn)組分別注射20 μg的組氨酸和組胺(均用PBS溶解為4 μL)。注射時(shí)輕輕將微量注射器針頭從翹嘴鱖的額骨和頂骨的中部連接處插入，將藥物緩慢注入到腦室內(nèi)，注畢留針1 min以防藥液外溢。注射完成后，將翹嘴鱖放入曝氣的清水中，待其恢復(fù)活力后立即轉(zhuǎn)入到試驗(yàn)缸內(nèi)，每缸投喂20尾麥瑞加拉鯪，通過(guò)定點(diǎn)計(jì)數(shù)每缸內(nèi)1、4、8、12、24 h剩余的餌料魚(yú)數(shù)量，統(tǒng)計(jì)每個(gè)時(shí)間段翹嘴鱖攝食餌料魚(yú)的數(shù)量，用攝食餌料魚(yú)的質(zhì)量與翹嘴鱖質(zhì)量的比值來(lái)計(jì)算出單尾翹嘴鱖在注射不同組試劑1、4、8、12、24 h時(shí)的累積攝食量。計(jì)算公式如下：攝食量=(初始的食物質(zhì)量-剩余的食物質(zhì)量)×相關(guān)因子[14]。 在腦室注射12 h后，每組隨機(jī)取6尾翹嘴鱖進(jìn)行麻醉，解剖取腦組織，經(jīng)液氮冷凍后，保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于后期分子生物學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。

2)細(xì)胞處理。參照文獻(xiàn)[15],取狀態(tài)活潑的翹嘴鱖，經(jīng)75%的乙醇浸泡消毒，用紗布擦除體表黏液，在超凈工作臺(tái)剖取鱖腦組織于DPBS中清洗，用剪刀鑷子去除多余的組織，然后將腦組織放入盛有AIM液的培養(yǎng)皿內(nèi)浸泡消毒1.5 h；吸掉培養(yǎng)皿中多余AIM液，用剪刀將腦組織剪成1 mm3大小的組織塊，將組織塊轉(zhuǎn)移到盛有膠原酶消化液的離心管中于28 ℃培養(yǎng)箱中消化2 h；加入L-15培養(yǎng)液輕輕吹打得到腦細(xì)胞，1 000 r/min室溫離心5 min后棄上清，隨后再用L-15培養(yǎng)液漂洗2次(1 000 r/min，室溫離心5 min)，最后將收集的鱖腦細(xì)胞加入原代培養(yǎng)液重懸后接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于28 ℃無(wú)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第4天更換原代培養(yǎng)液1次。在顯微鏡下觀察腦細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。在鱖腦原代細(xì)胞分離至第三代之后，即可進(jìn)行試驗(yàn)。本試驗(yàn)所采用的鱖腦細(xì)胞已經(jīng)Neu-N和β-tubulin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定純度[15]。在正式試驗(yàn)開(kāi)始前，將腦細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，鋪板至6孔板中，每個(gè)孔盛放2.0 mL培養(yǎng)液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后使用無(wú)添加試劑的L-15培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理18 h，再添加不同濃度的組氨酸和組胺，分別為0、1.0、2.0和3.0 mmol/L 4個(gè)濃度梯度，刺激30 min后收集細(xì)胞蛋白，刺激24 h后收集細(xì)胞RNA，于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于后期分子生物學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。本研究所選的刺激濃度是基于前人的研究[16]。

1.3 相關(guān)基因的表達(dá)水平檢測(cè)

利用TRIzol Reagent試劑(TaKaRa,日本)提取鱖腦組織和原代腦細(xì)胞的總RNA，再用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊，南京)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 方法測(cè)定鱖腦中雷帕霉素靶蛋白(Target of rapamycin,tor)、轉(zhuǎn)錄起始因子 4(Activating transcription factor 4,atf4)、神經(jīng)肽 Y(neuropeptideY,npy)、刺鼠相關(guān)蛋白(agouti-related protein,agrp)和一般氨基酸調(diào)控阻遏蛋白2(general amino acid control non-derepressible2,gcn2)基因的 mRNA 表達(dá)水平。反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL SYBR Green Supermix，上下游引物分別為0.4 μL，1 μL cDNA模板，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃，5 min；95 ℃，10 s；退火30 s(退火溫度見(jiàn)表1)，延伸30 s，共39個(gè)循環(huán)。每經(jīng)過(guò)1個(gè)循環(huán)，收集1次熒光強(qiáng)度信號(hào)，最后選用從翹嘴鱖中篩選出來(lái)的內(nèi)源性的看家基因rpl13a來(lái)校正模板量，使用2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。本試驗(yàn)所用到的熒光定量引物均采用Primer5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息 Table 1 Primer sequences used for the real-time PCR analysis

1.4 Western blot分析

吸掉6孔板中的培養(yǎng)基，用提前預(yù)冷的DPBS洗滌1次，每孔加入50 μL的蛋白裂解液(RIPA，碧云天生物技術(shù)有限公司)，裂解液中加入1%的蛋白酶抑制劑(PMSF)。用細(xì)胞刮將6孔板中的細(xì)胞收集在1.5 mL的離心管中，冰上靜置20 min，每隔5 min上下顛倒混勻1次。8 000 r/min 4 ℃離心20 min后，棄沉淀，留上清液，即得鱖腦細(xì)胞蛋白樣，于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。蛋白濃度的測(cè)定采用BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。蛋白變性時(shí)加入2×SDS蛋白上樣緩沖液，99 ℃煮沸5 min，以充分變性蛋白質(zhì)，冷卻后-20 ℃保存。配制聚丙烯酰胺凝膠(濃縮膠10%)，蛋白樣上樣量為20 μg，蛋白樣于濃縮膠中以80 V電壓電泳35 min，于分離膠中以200 V電壓電泳45 min。轉(zhuǎn)膜在冰上操作，恒流200 mA 電泳120 min，轉(zhuǎn)膜后，將膜放在含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉4 h后，用1×TBST洗膜3次，每次5 min。一抗：內(nèi)參抗體β-actin(博奧森，北京)的稀釋比例為1∶2 000，目的抗體p-S6(CST，美國(guó))的稀釋比例為1∶800，4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜后，洗膜3次，每次5 min；二抗：羊抗兔(Licor，美國(guó))的稀釋比例為1∶2 000，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h后，洗膜4次，每次8 min。用凝膠成像系統(tǒng)(LiCor Odyssey，美國(guó))對(duì)膜進(jìn)行顯影檢測(cè)，用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)之間采用單因素方差分析(ANOVA)，差異顯著后進(jìn)行Duncan’s多重比較。數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 組氨酸和組胺對(duì)翹嘴鱖攝食量的影響

腦室內(nèi)分別注射20 μg組氨酸和組胺后，翹嘴鱖的累積攝食量如圖1所示。與對(duì)照組相比，注射組氨酸和組胺1、4、8 h后并沒(méi)有引起翹嘴鱖的攝食量的變化(P>0.05)，但在12 h 后注射組氨酸組和組胺組翹嘴鱖的攝食量顯著降低(P<0.05)，這種抑制作用在注射24 h后會(huì)消失(P>0.05)。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Different little letter above the bars indicated significant difference (P<0.05).

2.2 腦室注射組氨酸和組胺對(duì)促食欲相關(guān)基因表達(dá)的影響

腦室注射組氨酸和組胺12 h后，促食欲相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果如圖2所示。腦室注射組氨酸和組胺均可引起促食欲因子npymRNA表達(dá)水平顯著性降低(P<0.05)，同時(shí)促食欲因子agrpmRNA表達(dá)水平有下降的趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.3 不同濃度的組氨酸和組胺處理對(duì)鱖腦細(xì)胞促食欲基因表達(dá)的影響

用不同濃度(0、1.0、2.0和3.0 mmol/L) 的組氨酸和組胺分別處理鱖腦原代細(xì)胞24 h后，促食欲基因npy和agrpmRNA的表達(dá)情況如圖3所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著組氨酸濃度的升高，npymRNA的表達(dá)量有所降低(P<0.05)(圖3A)，同時(shí)agrpmRNA的表達(dá)在1.0和3.0 mmol/L組氨酸的刺激下顯著性降低(P<0.05)(圖3B)。此外，不同濃度的組胺刺激鱖腦原代細(xì)胞并不會(huì)引起npy和agrpmRNA的表達(dá)變化(P>0.05)(圖3C、D)。

星號(hào)表示差異顯著。表4同。*indicated significant difference (P<0.05).The same as Fig.4.

條形上方標(biāo)記不同字母表明存在顯著差異(P<0.05)。Data with different letters above the bars indicated significant difference (P<0.05).

2.4 組氨酸對(duì)翹嘴鱖GCN2和mTOR信號(hào)通路的影響

腦室注射組氨酸后鱖腦GCN2和mTOR信號(hào)通路的表達(dá)情況如圖4所示。與對(duì)照組相比，腦室注射組氨酸可引起翹嘴鱖GCN2信號(hào)通路關(guān)鍵基因gcn2和atf4 mRNA表達(dá)水平顯著性降低(P<0.05)，但對(duì)mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵因子tormRNA表達(dá)水平無(wú)顯著性變化(P>0.05)。以濃度為2.0 mmol/L的組氨酸處理鱖腦細(xì)胞30 min后，Western-blot檢測(cè)mTOR信號(hào)通路下游關(guān)鍵蛋白p-S6的表達(dá)情況見(jiàn)圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比，組氨酸處理并沒(méi)有引起p-S6的表達(dá)變化(P>0.05)。

圖4 腦室注射組氨酸后鱖腦GCN2和mTOR信號(hào)通路的變化情況

圖5 組氨酸處理鱖腦細(xì)胞后mTOR信號(hào)通路的變化情況

3 討 論

食物中的氨基酸含量不足或過(guò)量以及氨基酸失衡均會(huì)使動(dòng)物食物攝入量受到抑制[17]。同時(shí)，某些氨基酸與神經(jīng)遞質(zhì)合成之間存在著某種關(guān)系，如色氨酸、酪氨酸和組氨酸分別控制5-羥色胺、兒茶酚胺和組胺的合成[18]。而且有研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射5-羥色胺能抑制魚(yú)類(lèi)攝食[19]。本研究結(jié)果顯示組氨酸和組胺對(duì)翹嘴鱖的攝食有顯著影響。ICV注射20 μg的組氨酸和組胺在12 h后均可顯著降低翹嘴鱖的食物攝入量 (P<0.05)，這表明一定劑量的組氨酸和組胺對(duì)翹嘴鱖具有抑制食物攝入的作用。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究也證實(shí)大腦中組氨酸和組胺的變化與食物攝入的調(diào)節(jié)有關(guān)，例如在貓腦室內(nèi)注射組胺會(huì)抑制貓進(jìn)食[20]；小鼠腹腔注射組氨酸可抑制食物攝入且與大腦中組氨酸和組胺含量的升高有關(guān)[4]；而腹腔內(nèi)給予組氨酸后，大鼠腦中的組胺會(huì)增加[21]。也有研究發(fā)現(xiàn)下丘腦中存在將組氨酸轉(zhuǎn)化為組胺的組氨酸脫羧酶[22]。這些結(jié)果表明，哺乳動(dòng)物中組氨酸可能通過(guò)激活組胺神經(jīng)元抑制食物攝入。因此，我們推測(cè)ICV注射組氨酸可能通過(guò)激活鱖腦組胺神經(jīng)元來(lái)抑制攝食。

魚(yú)類(lèi)的攝食活動(dòng)是由中樞攝食和外周飽食系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)的，而這種調(diào)節(jié)作用是通過(guò)促食欲因子和抑食欲因子來(lái)調(diào)控的，為了探究組氨酸和組胺對(duì)翹嘴鱖攝食產(chǎn)生影響的作用機(jī)制，本研究還測(cè)定了促食欲相關(guān)基因npy和agrpmRNA的表達(dá)水平。近年來(lái)，關(guān)于NPY和AGRP在魚(yú)類(lèi)的攝食調(diào)控中發(fā)揮重要作用的研究越來(lái)越多，例如腦室注射N(xiāo)PY可增加金魚(yú)的攝食量[23]，腹腔注射N(xiāo)PY可促進(jìn)尼羅羅非魚(yú)攝食量的增加[24],這一研究在草魚(yú)中也得到相同的結(jié)果[25]。同樣AgRP也被證明是一種與NPY相互配合的促進(jìn)食欲的調(diào)節(jié)因子，在魚(yú)類(lèi)中能發(fā)揮促進(jìn)攝食的效果[26]。本研究結(jié)果顯示腦室注射組氨酸和組胺12 h后可顯著性降低鱖腦npymRNA的表達(dá)，該結(jié)果與在哺乳動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)組氨酸可有效降低大鼠海馬區(qū)神經(jīng)肽 Y 表達(dá)結(jié)果[27]基本一致。這表明組氨酸和組胺可能通過(guò)抑制促食欲NPY神經(jīng)元的表達(dá)來(lái)抑制翹嘴鱖的食物攝入。同時(shí)，本研究還采用胰酶消化法分離鱖腦原代細(xì)胞，用不同濃度的組氨酸和組胺處理翹嘴鱖原代腦細(xì)胞，進(jìn)一步在細(xì)胞水平上探究組氨酸和組胺與促食欲因子NPY和AGRP的關(guān)系。研究結(jié)果表明，組氨酸處理可下調(diào)鱖腦細(xì)胞促食欲基因npy和agrpmRNA 的表達(dá)，進(jìn)而驗(yàn)證了在活體水平上組氨酸可抑制促食欲因子npymRNA的表達(dá)，影響翹嘴鱖的食物攝入。有證據(jù)表明，膳食中氨基酸不僅是蛋白質(zhì)合成的底物，而且在控制基因表達(dá)中也起著重要的作用[28-29]。有趣的是，我們用相同濃度梯度的組胺處理鱖腦原代腦細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)組胺并沒(méi)有引起npy和agrpmRNA的表達(dá)變化，這可能是組胺處理的濃度和發(fā)揮作用的時(shí)間與組氨酸不同所導(dǎo)致的差異。

越來(lái)越多的研究證實(shí)，mTOR和GCN2信號(hào)通路在動(dòng)物機(jī)體感應(yīng)氨基酸的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。GCN2信號(hào)通路主要是在動(dòng)物機(jī)體缺乏氨基酸時(shí)通過(guò)增加氨基酸來(lái)源的同時(shí)減少氨基酸的去路來(lái)維持動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的氨基酸處于一種相對(duì)平衡的狀態(tài)[9]。而mTOR信號(hào)通路則是在動(dòng)物機(jī)體攝入氨基酸充足條件下，主要通過(guò)增加氨基酸的消耗方式來(lái)維持機(jī)體內(nèi)氨基酸的平衡[10]。本研究結(jié)果顯示：ICV注射組氨酸可抑制鱖腦GCN2信號(hào)通路，這與之前的研究結(jié)果不一致。氨基酸缺乏誘導(dǎo)激活的GCN2路徑可激活多巴胺神經(jīng)元中ATF4，通過(guò)與γ-氨基丁酸受體1亞基(GABA(B)R1)直接互作，使得γ-氨基丁酸(GABA)信號(hào)通路抑制，同時(shí)促進(jìn)多巴胺的釋放，從而抑制攝食[30]。因此，我們推測(cè)，可能因?yàn)閷?duì)照組注射磷酸鹽緩沖溶液后使得鱖腦中氨基酸處于缺乏狀態(tài)，在注射組氨酸后，這種缺乏狀態(tài)得到補(bǔ)償，進(jìn)而抑制了鱖腦GCN2信號(hào)通路。有趣的是，ICV注射組氨酸可抑制攝食，但并沒(méi)有激活鱖腦mTOR信號(hào)通路,在細(xì)胞水平上也得到類(lèi)似的結(jié)果。這與對(duì)虹鱒的研究結(jié)果不一致，在虹鱒腦室內(nèi)注射亮氨酸可以激活下丘腦的mTOR信號(hào)通路，抑制虹鱒攝食[12]，這可能是氨基酸的種類(lèi)不同所造成的差異。

綜上所述，組氨酸和組胺均可抑制翹嘴鱖的食物攝入。本研究結(jié)果表明一定劑量的組氨酸和組胺可通過(guò)下調(diào)促食欲因子表達(dá)來(lái)抑制翹嘴鱖的食物攝入量。本研究結(jié)果為探索翹嘴鱖攝食調(diào)控機(jī)制提供了一定的科學(xué)依據(jù)。