宋志強(qiáng)，錢 葉，丁 祥，朱 淼，唐 賢，侯怡鈴*

(1.西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；2.西華師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009)

0 引言

靈芝(GanodermaLucidum)為靈芝屬真菌的總稱，作為我國(guó)具有悠久歷史的名貴中草藥和食用菌，近年來(lái)，已被各國(guó)學(xué)者廣泛研究。靈芝多糖多來(lái)源于靈芝的子實(shí)體、菌絲體孢子粉中分離得到，是靈芝中的有效生物活性成分[1]。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖一般由葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖等成分所組成[2-6]，糖苷鍵鏈接形式大多為β-(1→3)鍵、β-(1→4)鍵、β-(1→6)鍵和α-(1→6)鍵等[7-9]。

大量藥理研究結(jié)果表明，靈芝多糖具有免疫調(diào)控作用，青海雪靈芝多糖與東莞紫芝多糖能夠促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性、NO釋放量，同時(shí)，東莞紫芝多糖還能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-6的表達(dá)[10-11]。不同地區(qū)的黑靈芝多糖在促進(jìn)小鼠T、B淋巴細(xì)胞的增殖的過(guò)程中具有不同程度的作用，相較于贛南的黑靈芝多糖，江西贛州的黑靈芝多糖對(duì)于提高血清中 IL-2 和 TNF-α含量發(fā)揮著重要作用[12-13]。同時(shí)，靈芝多糖也具有抗氧化、抗腫瘤作用，海南赤芝靈芝多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力[14]；安徽產(chǎn)靈芝多糖能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[15]。以上研究表明，不同產(chǎn)地，不同品種靈芝多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性有一定的差異，在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等方面有不同程度的療效。

四川省小金縣地處川西北高原，是長(zhǎng)江、黃河源區(qū)的重要組成部分，地理位置獨(dú)特、生態(tài)戰(zhàn)略地位十分重要[16]。該地區(qū)地屬大陸性季風(fēng)高原型氣候，草甸和灌木叢繁茂，植被覆蓋面積較大，獨(dú)特的自然環(huán)境，造就了其生態(tài)環(huán)境、藥用植物資源物種及遺傳性狀的多樣性[17-18]，成為藏醫(yī)藥發(fā)展的重要搖籃[19]。采自于四川小金縣的野生靈芝子實(shí)體小，呈半圓形、近扇形或略圓形，表面呈暗褐色，有漆樣光澤和縱皺紋，有同心環(huán)紋但不明顯，木栓質(zhì)至木質(zhì)部位，呈淺黃至黃褐色。根據(jù)卯曉嵐[20]主編的《中國(guó)大型真菌》一書(shū)對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定為黃邊靈芝(G.luteomarginatum)(圖1)。目前，關(guān)于四川省小金縣野生黃邊靈芝的多糖結(jié)構(gòu)及免疫活性方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

圖1 四川小金縣野生黃邊靈芝Fig.1 Wild Ganoderma luteomarginatum in Xiaojin County, Sichuan Province

本研究以四川小金縣野生黃邊靈芝為研究對(duì)象，采用熱水浸提技術(shù)、乙醇醇沉法、柱層析技術(shù)分離純化靈芝多糖，通過(guò)高效凝膠滲透色譜(HPGPC)，紅外光譜技術(shù)(IR)，核磁共振譜(1H NMR和13C NMR)等對(duì)小金縣野生靈芝多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征并探究靈芝多糖的免疫調(diào)控能力。通過(guò)此研究有助于開(kāi)發(fā)利用四川小金縣野生黃邊靈芝多糖資源，并且為進(jìn)一步研究其免疫調(diào)控機(jī)制以及藥理作用方面提供理論參考的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

靈芝，四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣采集，經(jīng)西華師范大學(xué)環(huán)境工程與環(huán)境科學(xué)學(xué)院丁祥教授根據(jù)《中國(guó)大型真菌》一書(shū)進(jìn)行鑒定；T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；氯化鈉，成都市科龍化工試劑廠；DEAE纖維素，生興生物技術(shù)(南京)有限公司；無(wú)水乙醇，安徽安特生物化學(xué)有限公司；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8)，上海碧云天生物技術(shù)研究所；PBS緩沖液，本實(shí)驗(yàn)室提供；RPMI1 640培養(yǎng)基、無(wú)酚紅，美國(guó)gibco公司；0.5% Trypsin-EDTA，美國(guó)gibco公司；胎牛血清，Clark Bioscience；實(shí)驗(yàn)藥品均為分析純。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

3 100 系列CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司； Epoch酶標(biāo)儀，美國(guó)基因有限公司；96孔微量培養(yǎng)板，康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；AR 2130電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；LD4-2A型離心機(jī)，青島海爾股份有限公司；RE-2 000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HHS型恒溫水浴鍋，上海光地儀器設(shè)備有限公司；DMI 3 000徠卡倒置熒光顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 靈芝粗多糖的提取

稱取干燥的靈芝子實(shí)體250 g粉碎，以粉碎后靈芝子實(shí)體與蒸餾水1∶3的比例的在90 ℃條件下水浴6 h，煮3次；收集上清液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將靈芝多糖濃縮至200 mL，加入4倍體積的無(wú)水乙醇醇沉，對(duì)其進(jìn)行離心收集絮狀沉淀，沉淀反復(fù)凍融后除去不溶解雜質(zhì)，并采用sevage法脫去其中含有的蛋白，烘干后得到靈芝多糖的粗多糖[21-23]。

1.2.2 靈芝粗多糖的分離純化

精密稱取靈芝多糖的粗多糖10 mg，溶于10 mL蒸餾水中，將其在4 ℃，12 000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上清液，經(jīng)DEAE cellulose-52色譜柱[24]及SePHACE-S300凝膠柱[25]反復(fù)純化后，收集純化后的多糖溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL，透析，烘干后得到的多糖命名為靈芝多糖。靈芝多糖得率 =(靈芝多糖重量/子實(shí)體總重量)×100%

1.2.3 靈芝多糖的分子量測(cè)定

稱取5 mg靈芝多糖樣品，用1 mL蒸餾水溶解，使用高效凝膠滲透色譜法對(duì)靈芝多糖的分子量進(jìn)行測(cè)定[26]。測(cè)得的數(shù)據(jù)經(jīng)GPC軟件分析得到分子量[27]。

1.2.4 靈芝多糖的紅外光譜分析

稱取靈芝多糖樣品5 mg，與烘干后的KBr粉末一起充分研磨，壓片，用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1[28]的檢測(cè)范圍內(nèi)掃描檢測(cè)。

1.2.5 靈芝多糖的核磁共振分析

稱取靈芝多糖樣品20 mg溶解于D2O中，保存并在核磁共振儀上進(jìn)行測(cè)定， 600 MHz條件下測(cè)定1H NMR譜和13C NMR譜[29]。

1.2.6 靈芝多糖對(duì)T、B細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的增殖作用

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8試劑盒(cell counting kit)法測(cè)定靈芝多糖對(duì)T、B細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的影響[30]。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的靈芝多糖母液并加入細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為(2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL)的靈芝多糖溶液。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的LPS母液并加入細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，并配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的LPS溶液。

取T、B細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞，并用培養(yǎng)液稀釋至2×105細(xì)胞/mL，配制成細(xì)胞懸浮液。為了消除邊緣效應(yīng)，向96孔板的四周加入PBS緩沖液。再向其余的孔中分別加入100 μL的細(xì)胞稀釋液。在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，依次加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液(空白對(duì)照)、LPS(質(zhì)量濃度10 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照)以及質(zhì)量濃度為(2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL)的靈芝多糖溶液，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，每孔加入5 μL的CCK-8溶液，孵育3 h，在酶標(biāo)儀450 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，記錄并拍照、作圖。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)項(xiàng)目(Statistical Program for Social Sciences)SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，與空白對(duì)照組對(duì)比顯著用*表示，P<0.05，極顯著用**表示，P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃邊靈芝多糖得率

本研究從250 g黃邊靈芝子實(shí)體中提取到56 g的靈芝粗多糖，將靈芝粗多糖進(jìn)一步分離純化后，提取到靈芝多糖1.44 g，在黃邊靈芝子實(shí)體總量中的得糖率為0.576%。

2.2 高效凝膠滲透色譜(HPGPC)檢測(cè)結(jié)果

凝膠色譜技術(shù)作為一種快速而又簡(jiǎn)單的分離分析技術(shù)，主要用于高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)分析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試。本實(shí)驗(yàn)采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測(cè)定靈芝多糖的分子量。結(jié)果如圖2所示，在14 min左右出現(xiàn)單一峰，曲線呈近似對(duì)稱分布的曲線。

圖2 黃邊靈芝多糖的高效凝膠滲透色譜圖Fig.2 The high performance gel permeation chromatogram of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

多糖作為一種大分子高聚物，靈芝多糖的生理活性與分子量大小及分子量的分布密切相關(guān)。如圖3所示，通過(guò)高效凝膠滲透色譜測(cè)得的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的重均分子量Mw約為7. 96×103Da，是一種分子量較低的靈芝多糖。數(shù)均分子量Mn約為1. 05×103Da，分子量分布指數(shù)a為7.57，多分散系數(shù)為5.30，說(shuō)明分子量的分布較寬。

圖3 黃邊靈芝多糖的分子量Fig.3 The molecular weight of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.3 黃邊靈芝多糖的FTIR譜分析

本研究采用傅里葉紅外光譜技術(shù)(FTIR)在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定靈芝多糖的紅外吸收，并處理分析靈芝多糖的紅外光譜。如圖4所示，波數(shù)在3 438.90 cm-1處出現(xiàn)了一處寬吸收峰，并將此吸收峰指定為糖醇羥基O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 637.54 cm-1的吸收峰則指定為羰基C=O 非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰；1 401.20 cm-1附近的吸收峰是糖醇羥基-C-OH的面內(nèi)彎曲振動(dòng)，綜上描述了靈芝多糖在4 000～1 400 cm-1范圍內(nèi)的特征吸收峰。在1 250～1 000 cm-1指紋峰區(qū)域范圍內(nèi)的一組峰是由醚鍵C-O伸縮振動(dòng)引起的，即在1 108.62 cm-1處所出現(xiàn)的吸收峰；在600～650 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰可用來(lái)確定吡喃糖環(huán)的骨架結(jié)構(gòu)，因此根據(jù)619.33 cm-1峰的存在，我們可以推斷靈芝多糖中有吡喃糖作為其基本骨架[31]，紅外光譜結(jié)果還顯示此多糖成分均一，無(wú)其他結(jié)構(gòu)特征峰，是一種均一多糖。

圖4 黃邊靈芝多糖的傅里葉紅外光譜分析Fig.4 Fourier transform infrared spectra of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.4 黃邊靈芝多糖的1H-NMR圖譜分析

四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的1H-NMR譜如圖5所示：在1H-NMR核磁共振譜中，靈芝多糖含有3個(gè)異頭氫信號(hào)，分別為δ4.98、δ4.91、δ4.44。表明靈芝多糖由3種單糖組成。δ4.98、δ4.91處的氫信號(hào)指示為α-吡喃糖殘基，而δ 4.44處的異頭氫信號(hào)指示為β-吡喃糖殘基[31]，積分曲線顯示兩種α-吡喃糖殘基與β-吡喃糖殘基比為2∶2∶1，所以四川小金縣野生黃邊靈芝多糖以α-型糖苷鍵為主鏈，β-型糖苷鍵為側(cè)鏈，主鏈與側(cè)鏈之比為4∶1。在δ3.20～ 4.12處的吸收峰為2～6位碳上氫信號(hào)的重疊峰。

圖5 黃邊靈芝多糖的1H-NMR譜數(shù)據(jù)Fig.5 1H-NMR spectra of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.5 黃邊靈芝多糖的13C-NMR譜分析

四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的13C-NMR譜如圖6所示：δ102.48、δ101.43、δ97.74處有異頭碳信號(hào)，δ102.48、δ101.43處表明四川小金縣野生黃邊靈芝多糖具有α構(gòu)型，且δ97.74處表明四川小金縣野生黃邊靈芝多糖具有β構(gòu)型。同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)[32]，δ97～104 之間的區(qū)域的碳信號(hào)，即δ102.48、δ101.43、δ97.74處的共振信號(hào)歸為D型吡喃型單糖的異頭碳原子，該靈芝多糖在異頭碳δ100～103之間的區(qū)域中，δ102.48、δ101.43可歸屬于α-D-糖殘基的C1；δ97.74可歸屬于β-D-糖殘基的C1。13C-NMR譜的碳信號(hào)與氫譜的1H-NMR氫信號(hào)結(jié)果相吻合。

圖6 黃邊靈芝多糖的13C-NMR譜數(shù)據(jù)Fig.6 13C-NMR spectra of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.6 黃邊靈芝多糖對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖作用

T淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞，骨髓中的一部分多功能干細(xì)胞或前T細(xì)胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的T細(xì)胞。成熟的T細(xì)胞與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，破壞靶細(xì)胞膜，直接殺傷靶細(xì)胞，或者釋放淋巴因子，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等功能。由圖7可知，當(dāng)靈芝多糖的終質(zhì)量濃度為1.25～10 μg/mL時(shí)，隨著藥物濃度的增加，T細(xì)胞的增殖效果也逐漸增強(qiáng)，并且當(dāng)終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，促進(jìn) T 淋巴細(xì)胞增殖的效果最好，相比于空白對(duì)照組具有極顯著性差異(P<0.01)。值得注意的是，當(dāng)終質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，相比于空白對(duì)照組呈現(xiàn)增殖效果，具有極顯著性差異(P<0.01)，但效果弱于1.25～10 μg/mL實(shí)驗(yàn)組與LPS陽(yáng)性對(duì)照組，提示低濃度的靈芝多糖促進(jìn) T淋巴細(xì)胞增殖的效果較好, 且在1.25～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，與T淋巴細(xì)胞增殖效果呈正相關(guān)。

*. 與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**. 與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。圖7 黃邊靈芝多糖對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.7 Effects of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide on proliferation of T cells

本實(shí)驗(yàn)的T淋巴細(xì)胞增殖形態(tài)圖如圖8所示，結(jié)果顯示，空白組的T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)為圓型，多為成團(tuán)生長(zhǎng)，且以10個(gè)細(xì)胞左右成團(tuán)，加入四川小金縣野生黃邊靈芝多糖刺激后，細(xì)胞成團(tuán)量變大，細(xì)胞量逐漸增多，可達(dá)到幾十甚至上百個(gè)細(xì)胞成團(tuán)。當(dāng)用10 μg/mL濃度的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖刺激T淋巴細(xì)胞時(shí)，T淋巴細(xì)胞的成團(tuán)量最大。并且當(dāng)同等濃度(5 μg/mL)的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖和LPS刺激T淋巴細(xì)胞時(shí)，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖組相較于LPS組對(duì)于T淋巴細(xì)胞數(shù)量及成團(tuán)量刺激也較好。

注：1為空白組，2-6為黃邊靈芝多糖實(shí)驗(yàn)組，其質(zhì)量濃度分別為1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL，7為L(zhǎng)PS組(5 μg/mL)。圖8 黃邊靈芝多糖對(duì)T細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.8 Effect the cell morphology of T cell by Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.7 黃邊靈芝多糖對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖的影響

成熟的B淋巴細(xì)胞主要定居于淋巴結(jié)皮質(zhì)淺層的淋巴小結(jié)和脾臟的紅髓和白髓的淋巴小結(jié)內(nèi)。B淋巴細(xì)胞在抗原刺激下可分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞可合成和分泌抗體，從而發(fā)揮細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)等功能。由圖9可知，當(dāng)四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的終質(zhì)量濃度為2.5～10 μg/mL時(shí)，隨著藥物濃度的增加，B淋巴細(xì)胞的增殖效果也逐漸增強(qiáng)，并且當(dāng)終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的效果最好，相比于空白對(duì)照組具有極顯著性差異(P<0.01)；但當(dāng)終質(zhì)量濃度為1.25 μg/mL時(shí)，相比于空白對(duì)照組沒(méi)有明顯的增殖效果；值得注意的是，當(dāng)終質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，相比于空白對(duì)照組呈現(xiàn)增殖效果，具有顯著性差異(P<0.05)，但效果弱于2.5～10 μg/mL實(shí)驗(yàn)組，高于LPS陽(yáng)性對(duì)照組。提示中等濃度的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的效果較好，且在2.5～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，與B淋巴細(xì)胞增殖效果呈正相關(guān)。

注：*.與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**. 與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。圖9 黃邊靈芝多糖對(duì)B細(xì)胞增殖的影響Fig.9 Effects of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide on proliferation of B cells

本實(shí)驗(yàn)的B淋巴細(xì)胞增殖形態(tài)圖如圖10所示，結(jié)果顯示，空白組的B淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)為圓形，多為成團(tuán)生長(zhǎng)，且以10個(gè)細(xì)胞左右成團(tuán)，加入四川小金縣野生黃邊靈芝多糖刺激后，細(xì)胞成團(tuán)量變大，細(xì)胞量逐漸增多，可達(dá)到幾十甚至上百個(gè)細(xì)胞成團(tuán)。當(dāng)用10 μg/mL濃度的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖刺激B淋巴細(xì)胞時(shí)，B淋巴細(xì)胞的成團(tuán)量最大。并且當(dāng)同等濃度(5 μg/mL)的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖和LPS刺激B淋巴細(xì)胞時(shí)，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖組相較于LPS組對(duì)于B淋巴細(xì)胞數(shù)量及成團(tuán)量刺激也較好。

注：1為空白組，2-6為黃邊靈芝多糖實(shí)驗(yàn)組，其質(zhì)量濃度分別為1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL，7為L(zhǎng)PS組(5 μg/mL)。圖10 黃邊靈芝多糖對(duì)B細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.10 Effect the cell morphology of B cell by Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

2.8 靈芝多糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖的影響

RAW264.7 是由 Abelson 鼠白血病病毒誘導(dǎo) BALB/c小鼠產(chǎn)生腫瘤后收集小鼠腹水單核樣巨噬細(xì)胞得到的細(xì)胞株,具有很強(qiáng)的黏附和吞噬抗原的能力，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[33]。如圖11所示，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的終質(zhì)量濃度為2.5～10 μg/mL時(shí)，隨著藥物濃度的增加，RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖效果也逐漸增強(qiáng)，并且當(dāng)終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的效果最好，相比于空白對(duì)照組具有極顯著性差異(P<0.01)；提示低濃度的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖的效果較好，且在1.25～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，與RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖效果呈正相關(guān)。

注：*.與空白組相比差異顯著(P<0.05)；**. 與空白組相比差異極顯著(P<0.01)。圖11 黃邊靈芝多糖對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響Fig.11 Effects of Ganoderma luteomarginatum polysaccharide on proliferation of Macrophages cells

本實(shí)驗(yàn)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖形態(tài)如圖12所示。結(jié)果顯示，空白組的RAW264.7巨噬細(xì)胞為高折光圓形及部分細(xì)胞伸出偽足的狀態(tài)，貼壁生長(zhǎng)。在四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的刺激下，RAW264.7巨噬細(xì)胞伸出偽足，進(jìn)行分裂，且細(xì)胞量逐漸增加。當(dāng)用10 μg/mL濃度的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞時(shí)，增殖效果最好，細(xì)胞數(shù)量增殖最多。并且當(dāng)同等濃度(5 μg/mL)的四川小金縣野生黃邊靈芝多糖和LPS刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞時(shí)，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖組相較于LPS組對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞增殖作用也較好。

注：1為空白組，2-6為黃邊靈芝多糖實(shí)驗(yàn)組，其質(zhì)量濃度分別為1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL，7為L(zhǎng)PS組(5 μg/mL)。圖12 黃邊靈芝多糖對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.12 Effect the cell morphology of Macrophages cell by Ganoderma luteomarginatum polysaccharide

3 討論

本研究從小金縣野生黃邊靈芝中提取到一種糖成分，重均分子量Mw約為7.9×103Da，數(shù)均分子量約為1.05×103Da，分子量分布指數(shù)a為7.57，多分散系數(shù)為5.30，是由50個(gè)左右的單糖所組成的均一多糖。結(jié)構(gòu)分析顯示，該多糖結(jié)構(gòu)特征明顯，由3種單糖構(gòu)成，具有α-D -吡喃糖主鏈，β-D-吡喃糖側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，且主鏈與側(cè)鏈比為4∶1，是一種結(jié)構(gòu)新穎的均一多糖。

結(jié)構(gòu)決定理化性質(zhì)，并且多糖的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)都與其活性緊密相關(guān)，然而兩者并非單獨(dú)地影響多糖的活性。分子量的大小是多糖具備生物活性的必要條件，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一般多糖分子量大于10 kDa才具有較強(qiáng)的活性，小于該值則活性很低或沒(méi)有[7]。例如何晉浙等[34]從赤靈芝子實(shí)體中提取到分子量為8×104～2×105Da的靈芝多糖；劉艷芳等[35]從“滬農(nóng)靈芝1號(hào)”品種子實(shí)體中獲得分子量為2.28×106Da的靈芝多糖均具有較強(qiáng)的生物活性。而我們從四川小金縣野生黃邊靈芝中提取到的多糖分子量約為7.9×103Da，小于10 kDa，但該多糖免疫活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖仍然具有較強(qiáng)的生物活性。

除此之外，目前研究發(fā)現(xiàn)，大部分靈芝多糖以β-(1→3)糖苷鍵構(gòu)成主鏈，以β-(1→6)及β-(1→4)糖苷鍵構(gòu)成側(cè)鏈。劉艷芳[36]研究表明，從赤靈芝子實(shí)體中提取到的大分子量的β-(1→3)葡聚糖，具有較強(qiáng)的刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子的活性。王琪[37]研究表明，從靈芝子實(shí)體及水提物提取到主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、糖醛酸以2∶4∶1∶2組成的多糖LZ5-S和主要由半乳糖、葡萄糖、木糖和糖醛酸以2∶2∶1∶1組成的多糖LZ5-W-2-A具有刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的作用，并存在濃度依賴性。毛健[38]等研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖具有β-(1→3)和1→6的主鏈結(jié)構(gòu)，并且具有提高細(xì)胞免疫及體液免疫的作用。向俊宇[2]等研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖具有β-(1→3)的主鏈結(jié)構(gòu)，并且具有免疫調(diào)節(jié)作用。

不同品種的靈芝多糖不僅結(jié)構(gòu)會(huì)影響細(xì)胞的免疫活性方面，不同品種的靈芝多糖的濃度對(duì)免疫細(xì)胞增殖的效果也有所差異。連紫菀[39]等研究表明，在濃度范圍為25～100 μg/mL的雪靈芝多糖能夠促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的增殖，顯示出顯著的濃度依賴性刺激作用。顧菲菲[40]等研究表明，赤靈芝多糖在25～100 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)都具有較高免疫調(diào)節(jié)活性。張麗霞等[41]研究表明，靈芝孢子粉多糖在50～100 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的 TNF-α效果較好，并產(chǎn)生劑量依賴效果。

與不同品種的靈芝多糖的構(gòu)效和量效比較后發(fā)現(xiàn)，四川小金縣野生黃邊靈芝多糖不僅具有α主鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有β側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。同時(shí)多糖分支度與其生物活性有一定的關(guān)聯(lián)度，但并不呈線性關(guān)系。四川小金縣野生靈芝多糖的主鏈與側(cè)鏈比為4∶1，提示每四個(gè)單糖就有一個(gè)分支，分支較多。免疫活性實(shí)驗(yàn)顯示，四川小金縣野生靈芝多糖在1.25～20 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能夠有效地促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、RAW264.7巨噬細(xì)胞的增殖，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。并且，當(dāng)靈芝多糖終質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞RAW264.7的成團(tuán)增殖的效果最好。我們的研究結(jié)果表明β構(gòu)型的主鏈結(jié)構(gòu)并不是多糖活性的必需基團(tuán)，α構(gòu)型的主鏈結(jié)構(gòu)也具有較強(qiáng)的免疫活性。并且與其它品種的靈芝多糖相比較發(fā)現(xiàn)，本研究中的黃邊靈芝多糖在較低濃度范圍內(nèi)促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖的效果最好。

綜上研究為開(kāi)發(fā)和利用四川小金縣野生黃邊靈芝提供了一定的科學(xué)依據(jù)，但關(guān)于四川小金縣野生黃邊靈芝多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定及免疫調(diào)控作用的相關(guān)分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。